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(4)交换剂的基质是疏水性还是亲水性，对被分离物质有不同的作用性质(如吸附、分子筛、离子或非离子的作用力等)，因此对被分离物质的稳定性和分离效果均有影响。一般认为，在分离生命大分子物质时，选用亲水性基质的交换剂较为合适，它们对被分离物质的吸附和洗脱都比较温和，活性不易破坏。
(三)操作要点
1．交换剂的预处理、再生和转型
商品离子交换树脂为干树脂，要用水浸透使之充分吸水溶胀。又因含有一些水不溶性杂质，所以要用酸、碱处理除去。一般程序如下：干树脂用水浸泡2小时后减压抽去气泡，倾去水，再用大量去离子水洗至澄清，去水后加4倍量的2mol／LHCI溶液，搅拌4小时，除去酸液，用水洗至中性，再加4倍量的2mol／LNaOH溶液，搅拌4小时，除去碱液，用水洗至中性备用。其中处理用的酸碱浓度在不同实验条件下，可以有变动。
如果是亲水型离子交换剂，只能用0．5mol／LNaOH和0．5mol／LNaCl混合溶液或0．5mol／LHCI溶液处理(室温下处理30分钟)。
酸碱处理的次序决定了离子交换剂携带反离子的类型。在每次用酸或碱处理后，均应用水洗至近中性，再用碱或酸处理，后用水洗至中性，经缓冲溶液平衡后即可使用或装柱。用过的离子交换剂使其恢复原状的方法，称为“再生”。再生时并非每次都用酸碱反复处理，往往只要转型处理就行。所谓转型就是说使用时希望交换剂带何种反离子。长期使用后的树脂含杂质很多，欲将其除掉，应先用沸水处理，然后用酸、碱处理之。树脂若含有脂溶性杂质，可用乙醇或丙酮处理。长期使用过的亲水型离子交换剂的处理，一般只用酸、碱浸泡即可。对琼脂糖离子交换剂的处理，在使用前用蒸馏水漂洗，缓冲溶液平衡后即可。
2．交换剂装柱
(1)离子交换层析柱
实验室中简单的层析柱可用碱式滴定管代替。一般用玻璃或有机玻璃制成的管，底部熔接有3号烧结滤板，也可用玻璃纤维代替。柱的高度依分离物质的不同而定，当所用的交换剂与待分离物质各组分之间的亲和力相差不多而需要交换剂的体积较大时，以增加柱长为宜，使待分离的组分被洗脱后再结合于交换剂上的概率增加，使性质相近的组分能较好地分离，因而增加了分辨率。柱的直径与高度的比以1：20左右为宜。如采用离子强度较大的梯度洗脱时，以选用粗而短的柱子为宜。因为当柱上洗脱液的离子强度高到足以完全取代被吸附的离子时，这些被置换的离子则以同洗脱液等速率从柱上向下移动，如果柱细长，即从脱附到流出之间的距离长，使脱附的离子扩散的机会增加，结果造成分离峰过宽，降低分辨率。用交联葡聚糖离子交换剂和纤维素离子交换剂时，常用的柱高为15～20cm。
(2)装柱
转型再生好的交换剂先放人烧杯，加入少量水，边搅拌边倒人垂直固定的层析柱中，使交换剂缓慢沉降。交换剂在柱内必须分布均匀，不应有明显的分界线，严防气泡产生，否则将严重影响交换性能。为防止气泡和分界线(即所谓“节”)的出现，在装柱时，可在柱内先加入一定高度的水，一般为柱长的1／3，再加人交换剂就可借水的浮力而缓慢沉降。同时控制排液口放速率，以保持交换剂面上水的高度不变，交换剂就会连续地缓慢沉降，“节”和气泡就不会产生。
离子交换剂的装柱量要依据其全部交换量和待吸附物质的总量来计算。当溶液含有各种杂质时，必须考虑使交换量留有充分余地，实际交换量只能按理论交换量的25％～50％计算。在样品纯度很低时，或有效成分与杂质的性质相近时，实际交换量应控制得更低些。
3．样品上柱、洗脱和收集
装柱完毕，通过恒流泵加入起始缓冲溶液，流洗交换剂，直至流出液的pH与起始缓冲溶液相同。关闭层析柱出液口，准备加样。
打开柱出液口，待缓冲溶液下移至柱床表面时，关闭出液口。用滴管加入已用起始缓冲溶液平衡后的样品。沿柱内壁滴加样品，待样品液加到一定高度后，再移向中央滴加，务必使样品液均匀分布于柱床全表面。然后打开出液口，待样品液全部流人柱床时，先用少量起始缓冲溶液冲洗柱内壁，再接上洗脱装置，按一定速率加入洗脱液，开始层析分离。
一般分析用的样品液上柱量为床容量的1％～2％。制备用的样品量可适当加大。从交换剂上把被吸附的物质洗脱下来，一种方法是增加离子强度，将被吸附的离子置换出来；另一种是改变pH值，使被吸附离子解离度降低，从而减弱其对交换剂的亲和力而被脱附。
由于被吸附的物质不一定是所要求的单一物质，因此除了正确选择洗脱液外，还采用控制流速和分部收集的方法来获得所需的单一物质。因不同物质的极性不同，容易交换的先流出来，根据先后顺序就能得到较纯的物质。
洗脱液的流速不仅与所用交换剂的结构、颗粒大小及数量有关，而且与层析柱的粗细及洗脱液的粘度有关，很难定出一定的标准，必须根据具体条件，反复实验，才能得出适合于特定层析条件的洗脱液流速，一般控制在5～8mL／(cm2•h)。
经洗脱流出的溶液可用部分收集器分部收集，收集的体积一般以柱体积的1％～2％为宜。若降低分部收集体积，可提高分辨率。分部收集洗脱液经相关的检测分析，便可得知所含物质的数量。也可以用监测仪显示收集的洗脱液在特定波长的吸光度(A)代表被分离物质的浓度，以此为纵坐标，以相应的洗脱体积为横坐标，绘制出洗脱曲线。
离子交换层析中的洗脱是至关重要的一步，为了有效地从交换剂上将各种被吸附的物质分阶段洗脱下来，常采用梯度溶液进行洗脱，即所谓梯度洗脱。这种溶液的梯度由盐浓度或pH的变化而形成。前者是用一简单的盐(如NaCl或KCl)溶解于稀缓冲溶液中制成的；后者是用两种不同pH值或不同缓冲溶液制成的。
在某些实验条件下，离子交换层析的洗脱，也选用阶梯式或复合式梯度洗脱液。实践中采用何种形式的梯度洗脱，完全决定于分离要求，无规律可循。一般从线性梯度开始，然后逐步摸索试验，以获得适用于实验的合适洗脱方式。