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讨论：①溶剂的选择：只用用无水乙醇和无水甲醇才能得到满意的结果，其他溶剂因受到异烟肼盐酸盐在其中溶解度的限制不能采用。

②酸的种类和浓度以及异烟肼的浓度：当酸与异烟肼试剂的摩尔比为2：1时可获得吸收度。

③水分、温度、光线和氧的影响：当溶剂中含水量增高，吸收度随之降低。温度升高，反应加速。当在具塞玻管中不致使溶剂挥发及吸收水分的情况下，光与氧不影响反应。

④关于反应的专属性：具有Δ4-3-酮基的甾体激素在室温不到1h即可定量地与酸性异烟肼反应。其他甾酮化合物需在长时间放置或加热后方可反应完全，因此在上述反应条件下，本法对Δ4-3-酮甾体具有一定的专属性。

5.Kober反应比色法Kober反应是指雌激素与硫酸-乙醇共热呈色，用水或稀硫酸稀释后重新加热发生颜色改变，并在515nm附近有吸收。

Kober反应有两步：①与硫酸-乙醇光热产生黄色，在465nm处有吸收；②加水或稀硫酸稀释，重新加热显桃红色，在515nm处有吸收。

中国药典采用本法测定炔雌醇片及复方炔诺孕酮片、复方炔诺孕酮滴丸、复方左炔诺孕酮滴丸中的炔雌醇的含量。

维生素类药物维生素A维生素A的结构为具有一个共轭多烯侧链的环己烯，因而具有许多立体异构体。

天然维生素A主要是全反式维生素A.性质：具紫外吸收，易氧化变质，能与三氯化锑呈色，与氯仿、乙醚、环己烷或是由醚任意混合，在乙醇中微溶，在水中不溶。

鉴别试验①三氯化锑反应（Carr-price反应）：维生素A在饱和无水三氯化锑的无醇氯仿溶液中，即显蓝色，渐变成紫红色。

②紫外吸收光谱：维生素A分子中含有5个共轭双键，其无水乙醇溶液在波长326nm处有吸收。当在演算催化下加热，则发生去水反应而生成脱水维生素A.后者比维生素A多一个共轭双键，使其吸收峰红移，同时在350～390nm波长范围内出现3个吸收峰。

③薄层色谱：以硅胶G为吸附剂，环己烷-乙醚（80：20）为流动相。

含量测定：紫外分光光度法（三点校正法）

原理：本法是在三个波长处测定吸收度，根据校正公式计算吸收度A校正值后，再计算含量，故本法亦称"三点校正法".原理如下：

①杂质的吸收在310～340nm波长范围内呈一条直线，且随波长的增大，吸收度变小。

②物质对光的吸收具有加和性。

三点波长的选择法①第1点：选择维生素A的吸收波长（即λ1）。

②第2点和第3点：在吸收波长的两侧各选一点（即λ2和λ3）。

等波长差法：在λ1的左右各选一点为λ2和λ3，使λ3-λ1＝λ1-λ2.维生素A醋酸酯。

等吸收法：在λ1的左右各选一点为λ2和λ3，使Aλ2=Aλ3=6/7Aλ1.维生素A醇。

③维生素A2和维生素A3；维生素A的氧化产物（环氧化物、维生素A醛和维生素A酸）；维生素A在光照下产生的无生物活性的聚合物鲸醇；维生素A的异构体；合成时产生的中间体。

④测定方法：法（使用于维生素A醋酸酯）

取维生素A醋酸酯，精密称定，加环己烷制成每1ml中含9～15单位的溶液。然后在300、316、328、340、360nm五个波长处分别测定吸收值，确定吸收波长（应为328nm）。计算各波长下的吸收度与328nm波长下的吸收度的比值。

计算：

a.求吸收系数，吸收系数＝A/cl.b.求效价（U/g），U/g＝吸收系数×19001900为维生素A醋酸酯在环己烷溶液中测定的换算因数。

3.求维生素A醋酸酯胶丸为标示量的百分含量。

标示量%＝（A×D×1900×W）/（W×100×l×标示量）

1U=0.344μg维生素A醋酸酯1U=0.300μg维生素A醇4.A值的选择法第二法（适用于维生素A醇）

说明：

⑴维生素A醋酸酯的吸收度校正公式是用直线方程法（即代数法）推导出来的；维生素A醇的吸收度校正公式是用相似三角形法（几何法或成6/7定位法）推倒出来。

⑵在应用三点校正法时，除其中一点在吸收波长处测定外，其余两点均在吸收峰的两侧上升或下降陡部的波长处进行测定。

维生素E维生素E（消旋-α-生育酚醋酸酯）有天然片和合成品之分，天然品为右旋体（d-α）；合成品为消旋体（dl-α）。

结构：维生素E为苯丙二氢吡喃醇衍生物，苯环上又一个乙酰化的酚羟基，故又称生育酚。他主要有α、β、γ、δ四种异构体，其中以α异构体的生理作用强。

性质：

溶解性：微黄色或黄色透明的粘稠液体，易溶于乙醇、丙酮、乙醚、石油醚，不溶于水。

具有紫外吸收。

在无氧或其它氧化剂存在时，在酸性或碱性溶液中，加热可水解生成游离生育酚；在有氧或其它氧化剂存在时，则进一步氧化生成醌型化合物。在碱性条件下加热，这种氧化作用更易发生。

鉴别试验：

⑴硝酸反应：取本品约30mg，加无水乙醇10ml溶解后，加硝酸2ml，摇匀，在75℃加热约15min，溶液应显橙红色。

⑵水解后氧化反应：取本品约10mg，加醇制氢氧化钾试液2ml，煮沸5min，放冷，加水4ml与乙醚10ml，振摇、静置使分层，取乙醚液2ml，加2，2'-联吡啶的乙醇溶液（0.5→100）数滴和三氯化铁的乙醇溶液（0.2→100）数滴，应显血红色。

⑶紫外光谱法。

⑷薄层色谱法。

特殊杂质：

游离维生素E.利用游离维生素E的还原性，用硫酸铈滴定液（0.01mol/L）滴定，以二苯胺为指示剂，限量为2.15%.含量测定：

⑴气相色谱法：载气：氮气；固定相：硅酮（OV-17），涂布于经酸洗并硅烷化处理的硅藻土或高分子小球上；检测器：氢火焰离子化检测器；理论板数：按维生素E峰计算应不低于500；维生素E与内标物质的分离度应大于2.内标：正三十二烷。

⑵高效液相色谱法：C18柱；流动相为甲醇：水（49：1）；紫外检测器；波长292nm.维生素B1结构：维生素B1（盐酸硫胺）是由氨基嘧啶环和噻唑环通过央甲基连接而成的季铵化合物，噻唑环上季铵及嘧啶环上氨基，为两个碱性基团，可与酸成盐。

性质：

溶解性：本品在水中易溶，水溶液显酸性反应。在乙醇中微溶，在乙醚中不溶。

具有紫外吸收。

在碱性中遇氧化剂，如铁氰化钾，可被氧化为具有荧光的硫色素，后者溶液正丁醇中呈蓝色荧光。

分子中含有两个杂环，故可与某些生物碱沉淀试剂反应生成组成恒定的沉淀。

鉴别试验⑴硫色素反应方法：取本品约5mg，加氢氧化钠试液2.5ml溶解后，加铁氰化钾试液0.5ml与正丁醇5ml，强力振摇2min，放置使分层，上面的醇层显强烈的蓝色荧光。加酸使成酸性，荧光即消失。再加碱使成碱性，荧光又显出。

原理：维生素B1在碱性溶液中，可被铁氰化钾氧化生成硫色素。硫色素溶于正丁醇（或异丁醇等）中，显蓝色荧光。

⑵沉淀反应维生素B1与碘化汞生成淡黄色沉淀维生素B1与碘生成红色沉淀维生素B1与硅钨酸生成白色沉淀含量测定方法有：硅钨酸重量法、硫色素荧光法、非水溶液滴定法和紫外分光光度法。

中国药典收载紫外分光光度法维生素C结构：维生素C分子结构中具有二烯醇结构和内酯环，且有二个手性碳原子（C4、C5），因此不仅使维生素C性质极为活泼，且具旋光性。

性质：

溶解性：维生素C在水中易溶，水溶液呈酸性，在乙醇中略溶，在氯仿或乙醚中不溶。

结构遇糖类相似，也具糖的性质。

分子中二烯醇基具极强的还原性，易被氧化为二酮基而成为去氢抗维生素C，加氢又可还原为维生素C.在碱性溶液或强酸性溶液中能进一步水解为二酮古罗糖酸。

C3-OH由于受共轭效应的影响，酸性较强；C2-OH的酸性极弱，故维生素C一般表现为一元酸，能与碳酸氢钠作用生成钠盐。

分子中有两个手性碳原子，故有四个光学异构体，其中L（+）-维生素C活性强。

维生素C和碳酸钠作用可生成单钠盐，不致发生水解，因双键使内酯环变得较稳定；但在强碱中，内酯环可水解，生成酮酸盐。

维生素C有共轭双键，在稀矿酸溶液中，在245nm波长处有吸收；若在中性或碱性条件下，则红移至265nm处。