药物分析之西药分析——维生素D测定法

　　本法系用高效液相色谱法(附录Ⅴ Ｄ)测定维生素D(包括维生素D<[2]>和D<[3]>,下同)及其制剂、维生素AD制剂或鱼肝油中所含维生素D及前维生素D经折算成维生素D的总量，以单位表示，每单位相当于维生素D0.025μg。
　　测定应在半暗室中及避免氧化的情况下进行。
　　无维生素A醇及其他杂质干扰的供试品可用第一法测定，否则应按第二法处理后测 定；如果按第二法处理后，前维生素D峰仍受杂质干扰，仅有维生素D峰可以分离时，则应按第三法测定。
　　第一法
　　对照品贮备溶液的制备
　　根据各制剂中所含维生素D的成分,精密称取相应的维生素D<[2]>或D<[3]>对照品25mg,置100ml棕色量瓶中，加异辛烷80ml，避免加热，用超声处理助溶1分钟使完全溶解，加异辛烷至刻度，摇匀，充氮密塞，避光，0℃以下保存。
　　测定维生素D<[2]>时，应另取维生素D<[3]>对照品25mg，同法制成维生素D<[3]>对照品贮备溶液，供系统适用性试验用。
　　内标溶液的制备
　　称取邻苯二甲酸二甲酯25mg，置25ml量瓶中，加正己烷至刻度，摇匀。
　　色谱条件与系统适用性试验
　　用硅胶为填充剂，正己烷－正戊醇（997∶3）为流动相，检测波长为254nm。量取维生素D<[3]>对照品贮备溶液5ml，置具塞玻璃容器中，通氮后密塞，置90℃水浴中加热1小时，取出迅速冷却，加正己烷5ml，摇匀，置1cm具塞石英吸收池中，在2支8W主波长分别为254和365nm的紫外光灯下，将石英吸收池斜放成45°,并距灯管5～6cm,照射5分钟,使溶液中含有前维生素D<[3]>、反式维生素D<[3]>、维生素D<[3]>和速甾醇D<[3]>；取此溶液注入液相色谱仪，测定维生素D<[3]>的峰值，先后进样5次,相对标准偏差应不大于2.0％；前维生素D<[3]>(与维生素D<[3]>的比保留时间约为0.5)与反式维生素D<[3] >(与维生素D<[3]>的比保留时间约为 0.6)以及维生素D<[3]>与速甾醇D<[3]>(与维生素D<[3]>的比保留时间约为1.1)的峰分离度均应大于1.0。
　　校正因子测定
　　精密量取对照品贮备溶液和内标溶液各5ml,置50ml量瓶中，加正己烷至刻度，摇匀；取一定量注入液相色谱仪，计算维生素D的校正因子f<[1]>。
　　另精密量取对照品贮备溶液5ml置50ml量瓶中，加入2,6－二叔丁基对甲酚结晶1粒,通氮排除空气后，密塞，置90℃水浴中加热1．5小时，取出迅速冷却至室温，精密加内标溶液5ml，加正己烷至刻度，摇匀；取一定量注入液相色谱仪，计算前维生素D折算成维生素D的校正因子f<[2] >。
　　f<[2]>＝(A<[s]>·m<[r]>－f<[1]>m<[s]>A<[r1]>)／A<[r2]>·m<[s]>
　　式中
　　A<[s]>为内标的峰值；
　　m<[r]>为加入对照品的量；
　　f<[1]>为维生素D的校正因子；
　　m<[s]>为加入内标物质的量；
　　A<[r1]>为维生素D的峰值；
　　A<[r2]>为前维生素D的峰值。
　　含量测定