药物分析之西药分析——电泳法

　　扫描法
　　将干燥的醋酸纤维素薄膜用色谱扫描仪通过反射 （未透明薄膜） 或透射（已透明薄膜）方式在记录器上自动绘出各蛋白组分曲线图，横坐标为膜条的长度，纵坐标为吸收度，计算各蛋白组分的百分含量。亦可用微机处理积分计算。
　　三、琼脂糖凝胶电泳法
　　1.仪器装置
　　电泳室及直流电源同纸电泳。
　　2.试剂
　　(1) 醋酸－锂盐缓冲液(pH3.0)
　　取冰醋酸50ml，加水800ml混合后，用氢氧化锂调节pH至3.0，再加水至1000ml。
　　(2) 甲苯胺蓝溶液
　　取甲苯胺蓝0.1g，加水100ml使溶解。
　　3.操作法
　　(1)制胶
　　取琼脂糖约0.2g，加水10ml，置水浴中加热使溶胀完全,加温热的醋酸－锂盐缓冲液(pH3.0)10ml，混匀，趁热将胶液涂布于大小适宜(2.5cm×7.5cm或4cm×9cm)的玻璃板上，厚度约3mm，静置，待凝胶结成无气泡的均匀薄层，即得。
　　(2) 标准品溶液及供试品溶液的制备
　　照各药品项下规定配制。
　　(3) 点样与电泳
　　在电泳槽内加入醋酸－锂盐缓冲液(pH3.0),将凝胶板置于电泳槽架上，经滤纸桥浸入缓冲液。于凝胶板负极端分别点样1μl，立即接通电源，在电压梯度约30V/cm，电流强度1～2mA/cm的条件下，电泳约20分钟，关闭电源。
　　(4) 染色与脱色
　　取下凝胶板，用甲苯胺蓝溶液染色，用水洗去多余的染色液至背景无色为止。
　　四、聚丙烯酰胺凝胶电泳法
　　1.仪器装置
　　通常由稳流电泳仪和圆盘或平板电泳槽组成。其电泳室有上、下两槽,每个槽中都有固定的铂电极，铂电极经隔离电线接于电泳仪稳流挡上。
　　2.试剂
　　(1)溶液A
　　取三羟甲基氨基甲烷36.6g，四甲基乙二胺0.23ml,加0.1mol/L盐酸溶液48ml，再加水溶解并稀释至100ml,置棕色瓶内，在冰箱中保存。
　　(2)溶液B
　　取丙烯酰胺30.0g、次甲基双丙烯酰胺0.74g，加水溶解并稀释至100ml,滤过，置棕色瓶内，在冰箱中保存。
　　(3)电极缓冲液(pH8.3)
　　取三羟甲基氨基甲烷6g、甘氨酸28.8g,加水溶解并稀释至1000ml，置冰箱中保存，用前稀释10倍。
　　(4)溴酚蓝指示液
　　取溴酚蓝0.1g,加0.05mol/L氢氧化钠溶液3.0ml与90％乙醇5ml,微热使溶解，加20％乙醇制成250ml。
　　(5)染色液
　　取0.25％(W/V)考马斯亮蓝G<[250]>溶液2.5ml，加12.5％(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。
　　(6)稀染色液
　　取上述染色液2ml，加12.5％(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。
　　(7)脱色液
　　7％醋酸溶液。
　　3.操作法
　　(1)制胶
　　取溶液A2ml，溶液B5.4ml，加尿素2.9g使溶解，再加水4ml，混匀，抽气赶去溶液中气泡，加0.56％过硫酸铵溶液2ml，混匀制成胶液，立即用装有长针头的注射器或细滴管将胶液沿管壁加至底端有橡皮塞的小玻璃管(10×0.5cm)中,使胶层高度达6～7cm, 然后徐徐滴加水少量，使覆盖胶面，管底气泡必须赶走，静置约30分钟，待出现明显界面时即聚合完毕，吸去水层。
　　(2)标准品溶液及供试品溶液的制备
　　照各药品项下的规定。
　　(3)电泳
　　将已制好的凝胶玻璃管装入圆盘电泳槽内，每管加供试品或标准品溶液50～100μl，为防止扩散可加甘油或40％蔗糖溶液1～2滴及0.04％溴酚蓝指示液1滴,也可直接在上槽缓冲液中加0.04％溴酚蓝指示液数滴，玻璃管的上部用电极缓冲液充满，上端接负极、下端接正极。调节起始电流使每管为1mA，数分钟后，加大电流使每管为2～3mA，当溴酚蓝指示液移至距玻璃管底部1cm处，关闭电源。