药物分析之西药分析——玻璃酸酶测定法

 试剂
　　(1) 醋酸－醋酸钾缓冲液
　　取醋酸钾14g与冰醋酸20.5ml,加水使成1000ml。
　　(2) 磷酸盐缓冲液
　　取磷酸二氢钠2.5g、无水磷酸氢二钠1.0g与氯化钠8.2g，加水使成1000ml。
　　(3) 水解明胶
　　取明胶50g，加水1000ml，在121℃加热90分钟，然后冷冻干燥。
　　(4) 水解明胶稀释液
　　取磷酸盐缓冲液与水各250ml，加水解明胶330mg，摇匀，在0～4℃保存。如溶液不发生浑浊，可继续使用。
　　(5) 血清贮备液
　　取新鲜牛血清或冻干牛血清(先用水溶解并稀释至标示量体积)1份，加醋酸－醋酸钾缓冲液9份稀释，再以4mol/L盐酸溶液调节pH值至3.1，放置18～24小时后再用。在0～4℃保存，可应用30日。
　　(6) 血清溶液
　　血清贮备液中血清总固体(取牛血清适量，置装有洁净砂粒并在105℃干燥至恒重的坩埚中，置水浴上蒸干后，再在105℃干燥至恒重)在8％左右者,取1份,用醋酸－醋酸钾缓冲液3份稀释；血清总固体在5％左右者，取1份，用醋酸-醋酸钾缓冲液2份稀释；临用时配制。
　　(7) 玻璃酸钾贮备液
　　取预先经五氧化二磷减压干燥48小时的玻璃酸钾，加水制成每1ml中含0.5mg的溶液。在0℃以下保存，可应用30日。
　　(8) 玻璃酸钾溶液 取玻璃酸钾贮备液1份,用磷酸盐缓冲液1份稀释。临用时配制。
　　标准品溶液的制备
　　取玻璃酸酶标准品适量，精密称定，加冷的水解明胶稀释液制成每1ml中含1.5单位的溶液。临用时配制。
　　供试品溶液的制备
　　按估计单位精密称取供试品适量，加冷的水解明胶稀释液制成每1ml中含1.5单位的溶液。临用时配制。
　　标准曲线的制备
　　取大小相同的试管12支，按顺序加入标准品溶液0.00、0.10、0.20、0.30、0.40与0.50ml，每份2支；再依次相应加入水解明胶稀释液0.50、 0.40、0.30、0.20、0.10与0.00ml，每隔30秒钟顺序加入玻璃酸钾溶液0.50ml，使每一管的总体积为1.00ml,摇匀，置37 ±0.5水浴中；每管准确保温30分钟后，每间隔30秒钟顺序取出，立即顺序加入血清溶液4.0ml, 摇匀，在室温放置30分钟，摇匀，在640nm的波长处测定吸收度；同时以磷酸盐缓冲液0.50ml代替玻璃酸钾溶液,加水解明胶稀释液0.50ml,摇匀，按上述方法自 “置37±0.5℃的水浴中”起同样操作，作为空白。以吸收度为纵座标，标准品溶液的单位数为横座标绘制标准曲线。
　　测定法
　　取大小相同的试管6支，依次加供试品溶液0.20、0.30与0.40ml,每份2支;再依次相应加入水解明胶稀释液0.30、0.20与 0.10ml，照标准曲线的制备项下，自“每隔30秒钟顺序加入玻璃酸钾溶液0.50ml”起，依法测定，自标准曲线上查得单位数后，分别除以供试品的重量(mg), 算出6份供试品的平均数，即为玻璃酸酶的效价单位。