中药制剂——酶类制剂

　　为了减少提取液体积，可用多段逆流提取或柱型抽提法。液渣分离可用过滤法(如板框压滤、旋转真空过滤）或离心法。过滤时可加硅藻土、纸浆等为助滤剂。离心时可加入氢氧化铝凝胶、磷酸钙凝胶等以除去悬浮的胶体物质。
　　2)酶液的浓缩
　　提取的酶液为减少纯化操作容积，通常先进行浓缩。工业上可用真空减压浓缩、薄膜浓缩、冷冻浓缩和逆向渗透作用进行浓缩。对于少量酶液下述方法浓缩更合适：
　　用葡聚糖凝胶（分子筛）浓缩：取相当于酶液量1/5的干葡聚糖凝胶G15或G25，分次加入酶液中，搅拌30min，使凝胶吸水膨胀，进行吸滤。经重复数次操作即可在短时间内把酶液浓缩至所需的体积。也可将酶液装于透析袋内，埋入干凝胶中，袋内酶液也可得到浓缩。
　　用聚乙二醇浓缩：将稀酶液装入透析袋内，袋外复以聚乙二醇，袋内水份被袋外的聚乙二醇所吸收，在短时间内可以达到浓缩的目的，得到所需的浓酶液。
　　用超滤法浓缩：超滤技术在其可筛分范围内分离酶分子时不发生“相态”变化，可以避免酶蛋白变性，且分离度快，所以愈来愈被广泛采用。各种不同孔径的超滤膜，适用于实验室规模及一定工业规模的酶液浓缩。如国产二醋酸纤维素制成10～200埃孔径的超滤膜，用于实验室规模固氮酶液的脱盐和浓缩，效果良好。
　　3）杂质的去除
　　酶提取液中常含有杂蛋白、多糖、脂类及核酸等杂质，可用下述方法去除：
　　调PH和加热法：利用蛋白质对酸、碱和热变性方面性质的差异，可去除非活性杂蛋白。如制备脂肪酶时，在pH3、4时以400C温度加热150 min，淀粉酶活力可丧失90%而被除去，而脂肪酶活力仍保持80％以上。
　　蛋白质表面变性法：蛋白质表面变性后其性质有所不同，借以去除杂蛋白。如制备过氧化氢酶时，加入氯仿和乙醇进行振荡可以将杂蛋白变性而去除。。
　　蛋白质沉淀剂法：利用醋酸铝、利凡诺、单宁酸、离子型表 面活性剂等蛋白质沉淀剂可以去除杂蛋白及粘多糖类杂质。使用时要注意这类试剂常可引起酶变性失活，因此应迅速除去。
　　选择性变性法：各种蛋白质对变性剂的稳定性不同，可以用选择性变性剂去除杂蛋白。如细胞色素丙对三氯醋酸较稳定，所以在制备时可用2．5%三氯醋酸使其他杂蛋白变性使沉淀除去。
　　加保护剂热变性法：酶与底物或竞争性抑制剂结合后，其稳定性常显著增加。所以常用它们为保护剂，再用一些剧烈手段破坏杂蛋白，如用D-甲基苯甲酸为D-氨基酸氧化酶的保护剂，经加热除去杂蛋白，使该酶得到很好的提纯。
　　核酸沉淀剂法：酶液中的核酸类杂质，可以用氯化锰、鱼精蛋白硫酸盐等沉淀剂使其沉淀而除去。必要时，也可用核糖核酶将核酸降解后除去。
　　4)酶的纯化
　　酶是蛋白质，因此凡用于蛋白质的纯化手段均适用于酶的纯化，如盐析法、聚乙二醇沉淀法、有机浴剂分级沉淀法、等电点法、选择性沉淀法、各种柱层析法（吸附层析、离子交换层析、凝胶过滤）、各种电泳法及亲和层析等。不同之处是酶的纯化过程尚需选用迅速简便的活力测定方法，以追踪酶的去向。在选用酶的活力测定方法时，分析方法的迅速要比其精确度更为重要。如宁可要一个需时5min，准确度为5%的方法；也不要一个需时30min，准确度为0．5%的方法。在建立活力测定法之后，再根据各单元纯化步骤及活力分布情况用列表形式表达，表的内容包括：操作步骤、总体积、酶浓度（每毫升酶活力）、总活力、蛋白质浓度 mg/ml）、比活力（即纯度、酶活力单位/毫克蛋白）、产率%（每步总活力除以第一步的总活力）和纯化倍数（每步比活力除以第一步比活力）。
　　一个典型的酶纯化过程常包括多个单元操作，各单元操作如何串联，需靠实践摸索。每经过一个步骤一般可提高酶纯度2一3倍，总纯度可提高数千倍，而总产率常仅百分之几或十几。总的原则是选用最少的步骤而能取得最好的纯化效果、因为增加步骤势必增加酶的丢失。通常对于含盐浓度高的粗提取液一般不宜采用吸附法而多用盐析法；对于低离子强度的酶溶液则可用吸附法或离子交换法。交替使用不同分级沉淀法常比单独重复同一类型方法更能奏效。所以常将吸附法、盐折法和有机溶剂分级沉淀法串联起来进行纯化。当这些方法仍达不到要求时，还可以采用一些包括电泳、层析法在内的其他类型纯化方法。
　　当酶达到一定纯度时，便可以进行结晶，结晶也是纯化酶的有效手段之一。但应注意的是药用酶有些并不需要结晶。酶的第一次结晶纯度有时仍低于50％。酶的结晶通常可以在较纯的酶液中添加硫酸铵、氯化钠等盐达到一定饱和度，使酶慢慢结晶出来。此时必须控制温度和pH值。盐浓度要逐渐提高，添加速度要慢，才能得到较好的结晶。有时在低温下，用丙酮、乙醇等有机溶剂进行结晶。近年来采用平衡透析法，即将酶液装人透析袋中，置于一定饱和度的盐溶液中进行透折，这种操作可以获得大量结晶。