本法系利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，采用量反应平行线原理的设计，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定供试品效价的一种方法。 标准品的品种、分子式及理论计算值见表2.培养基及其制备方法培养基I胨5g琼脂15～20g牛肉浸出粉3g水1000ml磷酸氢二钾3g除琼脂外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为7.8～8.0或6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。培养基Ⅱ胨6g葡萄糖1g牛肉浸出粉1.5g琼脂15～20g酵母浸出粉6g水1000ml除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.8～8.0或6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。培养基Ⅲ胨5g磷酸氢二钾3.68g牛肉浸出粉1.5g磷酸二氢钾1.32g酵母浸出粉3g葡萄糖1g氯化钠3.5g水1000ml除葡萄糖外，混合上述成分，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.0～7.2，在115℃灭菌30分钟。培养基Ⅳ胨10g葡萄糖10g氯化钠10g琼脂20～30g枸橼酸钠10g水1000ml除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，在109℃加热15分钟，于70℃以上保温静置1小时后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为6.0～6.2，在115℃灭菌30分钟。培养基Ⅴ胨10g琼脂15～20g麦芽糖40g水1000ml除琼脂和麦芽糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加麦芽糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.2～7.4，按需要分装，在115℃灭菌30分钟，趁热斜放使凝固成斜面。
培养基Ⅵ胨8g磷酸二氢钾1g 牛肉浸出粉3g 葡萄糖2.5g酵母浸出粉5g琼脂15～20g氯化钠45g水1000ml 磷酸氢二钾 3.3g 除琼脂和葡萄糖外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调节pH值使灭菌后为7.2～7.4，在115℃灭菌30分钟。培养基Ⅶ胨5g枸橼酸钠10g牛肉浸出粉3g琼脂15～20g磷酸氢二钾7g水1000ml磷酸二氢钾3g除琼脂外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为6.5～6.6，在115℃灭菌30分钟。培养基Ⅷ酵母浸出粉1g琼脂15～20g硫酸铵1g磷酸盐缓冲液（pH6.0）1000ml葡萄糖5g混合上述成分，加热溶化后滤过，在115℃灭菌30分钟。营养琼脂培养基胨10g琼脂15～20g氯化钠5g肉浸液1000ml除琼脂外，混合上述成分，调节pH使比最终的pH值略高0.2～0.4，加入琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为7.2～7.4，分装，在115℃灭菌30分钟，趁热斜放使凝固成斜面。培养基可以采用相同成分的干燥培养基代替，临用时，照使用说明配制和灭菌，备用。灭菌缓冲液磷酸盐缓冲液（pH6.0）取磷酸氢二钾2g与磷酸二氢钾8g，加水使成1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟。
磷酸盐缓冲液（pH7.8）取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加水使成1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟。
磷酸盐缓冲液（pH10.5）取磷酸氢二钾35g，加10mol/L氢氧化钾溶液2ml，加水使成1000ml，滤过，在115℃灭菌30分钟。菌悬液的制备枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）悬液取枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35～37℃培养7日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85％以上。用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）悬液 取短小芽孢杆菌［CMCC（B）63202］的营养琼脂斜面培养物，照上述方法制备。金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）悬液取金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。
藤黄微球菌（Micrococcusluteus）悬液取藤黄微球菌［CMCC（B）28001］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在26～27℃培养24小时，或采用适当方法制备的菌斜面，用培养基Ⅲ或0.9％灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。大肠杆菌（Escherichiacoli）悬液取大肠杆菌［CMCC（B）44103］的营养琼脂斜面培养物，接种于营养琼脂斜面上，在35～37℃培养20～22小时。临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。啤酒酵母菌（Saccharomycescerevisiae）悬液取啤酒酵母菌（9763）的V号培养基琼脂斜面培养物，接种于Ⅳ号培养基琼脂斜面上。在32～35℃培养24小时，用灭菌水将菌苔洗下置含有灭菌玻璃珠的试管中，振摇均匀，备用。标准品溶液的制备标准品的使用和保存，应照标准品说明书的规定。临用时照表1的规定进行稀释。供试品溶液的制备精密称（或量）取供试品适量，用各药品项下规定的溶剂溶解后，再按估计效价或标示量照表1的规定稀释至与标准品相当的浓度。双碟的制备取直径约90mm、高16～17mm的平底双碟，分别注入加热融化的培养基（照表1）20ml，使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层。另取培养基适量加热融化后，放冷至48～50℃（芽孢可至60℃），加入规定的试验菌悬液适量（能得清晰的抑菌圈为度。二剂量法标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径在18～22mm，三剂量法标准品溶液的中心浓度所致的抑菌圈直径在15～18mm），摇匀，在每1双碟中分别加入5ml，使在底层上均匀摊布，作为菌层。放置水平台上冷却后，在每1双碟中以等距离均匀安置不锈钢小管（内径6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，外径7.8±0.1mm）4个（二剂量法）或6个（三剂量法），用陶瓦圆盖覆盖备用。
检定法二剂量法取照上述方法制备的双碟不得少于4个，在每1双碟中对角的2个不锈钢小管中分别滴装高浓度及低浓度的标准品溶液，其余2个小管中分别滴装相应的高低两种浓度的供试品溶液；高、低浓度的剂距为2：1或4：1.在规定条件下培养后，测量各个抑菌圈的直径（或面积），照生物检定统计法（附录ⅩⅣ）中的（2.2）法进行可靠性测验及效价计算。三剂量法取照上述方法制备的双碟不得少于6个，在每1双碟中间隔的3个不锈钢小管中分别滴装高浓度（S<[3]>）、中浓度（S<[2]>）及低浓度（S<[1]>）的标准品溶液，其余3个小管分别滴装相应的高、中、低三种浓度的供试品溶液；三种浓度的剂距为1∶0.8.在规定条件下培养后，测量各个抑菌圈的直径（或面积），照生物检定统计法（附录ⅩⅣ）中的（3.3）法进行可靠性测验及效价计算。
本法计算所得效价，如低于估计效价的90％或高于估计效价的110％时，则应调整其估计效价，予以重试。
除另有规定外，本法的可信限率不得大于5％。
