三、质量分析器
质量分析器将带电离子根据其质荷比加以分离,用于纪录各种离子的质量数和丰度。质量分析器的两个主要技术参数是所能测定的质荷比的范围(质量范围)和分辨率。
1.扇形磁分析器
离子源中生成的离子通过扇形磁场和狭缝聚焦形成离子束。离子离开离子源后,进入垂直于其前进方向的磁场。不同质荷比的离子在磁场的作用下,前进方向产生不同的偏转,从而使离子束发散。由于不同质荷比的离子在扇形磁场中有其特有的运动曲率半径,通过改变磁场强度,检测依次通过狭缝出口的离子,从而实现离子的空间分离,形成质谱。
2.四极杆分析器
因其由四根平行的棒状电极组成而得名。离子束在与棒状电极平行的轴上聚焦,一个直流固定电压(DC)和一个射频电压(RF)作用在棒状电极上,两对电极之间的电位相反。对于给定的直流和射频电压,特定质荷比的离子在轴向稳定运动,其他质荷比的离子则与电极碰撞湮灭。将DC和RF以固定的斜率变化,可以实现质谱扫描功能。四极杆分析器对选择离子分析具有较高的灵敏度。
3.离子阱分析器
由两个端盖电极和位于它们之间的类似四极杆的环电极构成。端盖电极施加直流电压或接地,环电极施加射频电压(RF),通过施加适当电压就可以形成一个势能阱(离子阱)。根据RF电压的大小,离子阱就可捕获某一质量范围的离子。离子阱可以储存离子,待离子累积到一定数量后,升高环电极上的RF电压,离子按质量从高到低的次序依次离开离子阱,被电子倍增监测器检测。目前离子阱分析器已发展到可以分析质荷比高达数千的离子。离子阱在全扫描模式下仍然具有较高灵敏度,而且单个离子阱通过时间序列的设定就可以实现多级质谱(MSn)的功能。
4.飞行时间分析器
具有相同动能,不同质量的离子,因其飞行速度不同而分离。如果固定离子飞行距离,则不同质量离子的飞行时间不同,质量小的离子飞行时间短而首先到达检测器。各种离子的飞行时间与质荷比的平方根成正比。离子以离散包的形式引入质谱仪, 医学教育 网搜集 整理 这样可以统一飞行的起点,依次测量飞行时间。离子包通过一个脉冲或者一个栅系统连续产生,但只在一特定的时间引入飞行管。新发展的飞行时间分析器具有大的质量分析范围和较高的质量分辨率,尤其适合蛋白等生物大分子分析。
5.傅里叶变换分析器
在一定强度的磁场中,离子做圆周运动,离子运行轨道受共振变换电场限制。当变换电场频率和回旋频率相同时,离子稳定加速,运动轨道半径越来越大,动能也越来越大。当电场消失时,沿轨道飞行的离子在电极上产生交变电流。对信号频率进行分析可得出离子质量。将时间与相应的频率谱利用计算机经过傅里叶变换形成质谱。其优点为分辨率很高,质荷比可以精确到千分之一道尔顿。
四、串联质谱及联用技术
1.串联质谱
两个或更多的质谱连接在一起,称为串联质谱。最简单的串联质谱(MS/MS)由两个质谱串联而成,其中第一个质量分析器(MS1)将离子预分离或加能量修饰,由第二级质量分析器(MS2)分析结果。最常见的串联质谱为三级四极杆串联质谱。第一级和第三级四极杆分析器分别为MS1和MS2,第二级四极杆分析器所起作用是将从MS1得到的各个峰进行轰击,实现母离子碎裂后进入MS2再行分析。现在出现了多种质量分析器组成的串联质谱,如四极杆-飞行时间串联质谱(Q-TOF)和飞行时间-飞行时间(TOF-TOF)串联质谱等,大大扩展了应用范围。离子阱和傅里叶变换分析器可在不同时间顺序实现时间序列多级质谱扫描功能。
MS/MS最基本的功能包括能说明MS1中的母离子和MS2中的子离子间的联系。根据MS1和MS2的扫描模式,如子离子扫描、母离子扫描和中性碎片丢失扫描,可以查明不同质量数离子间的关系。母离子的碎裂可以通过以下方式实现:碰撞诱导解离,表面诱导解离和激光诱导解离。不用激发即可解离则称为亚稳态分解。
MS/MS在混合物分析中有很多优势。在质谱与气相色谱或液相色谱联用时,即使色谱未能将物质完全分离,也可以进行鉴定。MS/MS可从样品中选择母离子进行分析,而不受其他物质干扰。
MS/MS在药物领域有很多应用。子离子扫描可获得药物主要成分,杂质和其他物质的母离子的定性信息,有助于未知物的鉴别,也可用于肽和蛋白质氨基酸序列的鉴别。
在药物代谢动力学研究中,对生物复杂基质中低浓度样品进行定量分析,可用多反应监测模式(multiplereactionmonitoring,MRM)消除干扰。如分析药物中某特定离子,而来自基质中其他化合物的信号可能会掩盖检测信号,用MS1/MS2对特定离子的碎片进行选择监测可以消除干扰。MRM也可同时定量分析多个化合物。在药物代谢研究中,为发现与代谢前物质具有相同结构特征的分子,使用中性碎片丢失扫描能找到所有丢失同种功能团的离子,如羧酸丢失中性二氧化碳。如果丢失的碎片是离子形式,则母离子扫描能找到所有丢失这种碎片的离子。
2.联用技术
色谱可作为质谱的样品导入装置,并对样品进行初步分离纯化,因此色谱/质谱联用技术可对复杂体系进行分离分析。因为色谱可得到化合物的保留时间,质谱可给出化合物的分子量和结构信息,故对复杂体系或混合物中化合物的鉴别和测定非常有效。在这些联用技术中,芯片/质谱联用(Chip/MS)显示了良好前景,但目前尚不成熟,而气相色谱/质谱联用和液相色谱/质谱联用等已经广泛用于药物分析。
(1)气相色谱/质谱联用(GC/MS)
气相色谱的流出物已经是气相状态,可直接导入质谱。由于气相色谱与质谱的工作压力相差几个数量级,开始联用时在它们之间使用了各种气体分离器以解决工作压力的差异。随着毛细管气相色谱的应用和高速真空泵的使用,现在气相色谱流出物已可直接导入质谱。
(2)液相色谱/质谱联用(HPLC/MS)
液相色谱/质谱联用的接口前已论及,主要用于分析GC/MS不能分析,或热稳定性差,强极性和高分子量的物质,如生物样品(药物与其代谢产物)和生物大分子(肽、蛋白、核酸和多糖)。
(3)毛细管电泳/质谱联用(CE/MS)和芯片/质谱联用(Chip/MS)
毛细管电泳(CE)适用于分离分析极微量样品(nl体积)和特定用途(如手性对映体分离等)。CE流出物可直接导入质谱,或加入辅助流动相以达到和质谱仪相匹配。微流控芯片技术是近年来发展迅速,可实现分离、过滤、衍生等多种实验室技术于一块芯片上的微型化技术,具有高通量、微型化等优点,目前也已实现芯片和质谱联用,但尚未商品化。
(4)超临界流体色谱/质谱联用(SFC/MS)
常用超临界流体二氧化碳作流动相的SFC适用于小极性和中等极性物质的分离分析,通过色谱柱和离子源之间的分离器可实现SFC和MS联用。
(5)等离子体发射光谱/质谱联用(ICP/MS)
由ICP作为离子源和MS实现联用,主要用于元素分析和元素形态分析。
五、数据处理和应用
检测器通常为光电倍增器或电子倍增器,所采集的信号经放大并转化为数字信号,计算机进行处理后得到质谱图。质谱离子的多少用丰度表示(abundance)表示,即具有某质荷比离子的数量。由于某个具体离子的“数量”无法测定,故一般用相对丰度表示其强度,即最强的峰叫基峰(basepeak),其他离子的丰度用相对于基峰的百分数表示。在质谱仪测定的质量范围内,由离子的质荷比和其相对丰度构成质谱图。在LC/MS和GC/MS中,常用各分析物质的色谱保留时间和由质谱得到其离子的相对强度组成色谱总离子流图。也可确定某固定的质荷比,对整个色谱流出物进行选择离子检测(selectedionmonitoring,SIM),得到选择离子流图。质谱仪分离离子的能力称为分辨率,通常定义为高度相同的相邻两峰,当两峰的峰谷高度为峰高的10%时,两峰质量的平均值与它们的质量差的比值。对于低、中、高分辨率的质谱,分别是指其分辨率在100~2000、2000~10000和10000以上。
质谱在药物领域的主要应用为药物的定性鉴别、定量分析和结构解析。
如果一个中性分子丢失或得到一个电子,则分子离子的质荷比与该分子质量数相同。使用高分辨率质谱可得到离子的精确质量数,然后计算出该化合物的分子式,或者用参照物作峰匹配可以确证分子量和分子式。分子离子的各种化学键发生断裂后形成碎片离子,由此可推断其裂解方式,得到相应的结构信息。
质谱用于定量分析,其选择性、精度和准确度较高。化合物通过直接进样或利用气相色谱和液相色谱分离纯化后再导入质谱。质谱定量分析用外标法或内标法,后者精度高于前者。定量分析中的内标可选用类似结构物质或同位素物质。前者成本低,但精度和准确度以使用同位素物质为高。使用同位素物质为内标时,要求在进样、分离和离子化过程中不会丢失同位素物质。在使用FAB质谱和LC/MS(热喷雾和电喷雾)进行定量分析时,一般都需要用稳定的同位素内标。分析物和内标离子的相对丰度采用选择离子监测(只监测分析物和内标的特定离子)的方式测定。选择离子监测相对全范围扫描而言,由于离子流积分时间长而增加了选择性和灵敏度。利用分析物和内标的色谱峰面积或峰高比得出校正曲线,然后计算样品中分析物的色谱峰面积或它的量。