3.低温间歇灭菌法 此法是将待灭菌的制剂或药品，用60－80℃加热1小时，将其中的细菌繁殖体杀死，然后在室温或孵卵箱中放置24小时，让其中的芽胞发育成为繁殖体，再二次加热将其消灭为止。加热和放置需连续操作三次以上，至全部芽胞消灭为止。此法适用于必须用热法灭菌但又不耐较高温度的制剂或药品。本法的缺点，不仅需要时间长，并且消灭芽胞的效果常不够完全，应用本法灭菌的制剂或药品，除本身具有抑制力者外，须加适量抑菌剂，以增加灭菌效力医学教育网搜集整理
4.影响湿热灭菌的因素
（1）微生物的种类和数量：各细菌对热的抵抗力相差很大，处于不同发育阶段，所需灭菌的湿度与时间也不相同，繁殖期的微生物对高温比衰老时期的抵抗力小得多。前面已经指出，每个容器的细菌数，控制在10个以内为宜。最初菌数愈少，达到灭菌时间愈短。同时，最初菌数增多也增加了耐热个体出现的几率。即使细菌全部杀灭，而注射液中细菌体过多，亦会引起临床上的不良反应，所以整个性产过过程应尽可能避免微生物污染，尽可能缩短生产过程，并力求在灌封后立即菌。
（2）注射液的性质：注射液若含有营养物质，如糖类，蛋白质等，对微生物可能有一种保护作用，能增强其抗热性。此外，药液pH对细菌的活性也有影响。一般微生物在中性液中耐热性最大，在碱性溶液中次之；酸性不利于微生物的发育。所以，一般在生物碱盐类的注射液，因pH 较低，用流通蒸气灭菌即可。加有适当抑菌剂时，药液经100℃30分钟加热，可杀死抵力强芽胞。有些药典采用此种灭菌方法所用的抑菌剂为甲酚（0.1－ 0.3%）、氯甲酚（0.05％－0.1%）、苯酚（0.1％－0.5%）、三氯叔丁醇（0.2％－0.5%）、硝酸苯汞或醋酸苯汞（0.001％－ 0.002%）。
（3）药物的稳定性：温度增高，化学反应速度增加：时间愈长，起反应的物质愈多。因此，不能只看到灭菌杀死细菌的一面，也要看到保证药物有效性的一面。为此在能达到灭菌的前提下，可适当降低湿度或缩短时间。实践证明在力求避免微生物污染和严格质量控制的条件下，维生素C注射液用流通蒸气15分钟灭菌，氯化钠注射注用 115℃30分钟是可行的。
（三）紫外线灭菌法 一般用于灭菌的紫外线波长是200－300nm，灭菌力最强的是波长为254nm4的紫外线。紫外线进行直线传播，其强度与距离平方成比例地减弱，并可被不同的表面反射。其穿透作用微弱，但较易穿透清洁空气及纯净的水，其中悬浮物或水中盐类增多时，则穿透程度显著下降。所以紫外线广泛作空气灭菌和表面灭菌之用。一般在6－15m3的空间可装置30瓦（或36－48）紫外线灯一只，灯距离地面以2.5m到3m为宜。湿度过大可降低灭菌效果，相对湿度以45％－60％比较适宜。湿度宜于10－55℃范围。紫外线灯管秘须保证无尘油垢，否则辐射强度将大力为降低。普通玻璃可吸收紫外线。因此安瓿中药物不能用此法灭菌。
紫外线的杀菌效率，还取决于微生物的敏感性。如于一平面上辐射强度为通常应用的最小强度2mw/cm2（30瓦紫外线灯于距1米处强度为85 mw/cm2）时杀死枯草杆菌芽胞需1100秒，而对溶血性链球菌，则仅需275秒。可粗略认为在紫外线灯下直接暴露，一般繁殖型微生物约3－5分钟，芽胞约10分钟即可死亡。唯紫外线对酵母特别是霉菌杀菌力较弱。紫外线对人体如照射过久，能产生结合膜炎及皮肤烧灼等现象。一般均在操作前启紫外线灯约半小时至一小时，然后进行操作。各种规格的紫外线灯，皆规定了有效使用时即，一般为3，000小时。故每次使用应登记开启时间，并定期进行来菌效果的检查，也可用具有对254nm灵敏的照度计，来测定其辐射强度。
（四）过滤除菌法 过滤除菌法，是使药物溶液通过无菌的特定滤器，除去活的或死的微生物而得到不含微生物的滤液。适于很不耐热的药液的灭菌。供来菌用的滤器。要球能有效地从溶液中除净微生物，溶液顺畅地由滤器通过，滤液中不落入任何所不需要的物质，滤器容易清洗，操作简便。
繁殖型细菌很少有小于1μm 者，芽胞大小为0.5μm或更小些，所以，对于以过筛作用滤过的滤器，例如纤维素酯膜滤器。其孔径大秘须小到足以阻止细胞和芽进入滤孔之内，大约为 0.2μm.靠阻留于孔道之内或静电作用的滤器，孔径可稍大于所要滤除的颗粒，但如压力过大或波动，颗粒有被挤过的可能。滤孔径要进行检查，最常用测定孔径的方法，是用大小为0.7μm左右的灵菌（Bprodigiosus）混悬液滤过，滤液通过培养试验，观察有无灵菌滤过。医学教育网搜集整理
近年来广泛采用微孔薄膜作灭菌滤器，膜滤器的性能详见注射剂一章滤器的种类与选择项下，作灭菌过滤一般选用孔径0.22μm的滤膜。G6号垂熔玻璃漏斗，其滤孔直径在2μm以下，可以除去细菌，对药物不吸附，也不影响药液的pH，常灭菌滤器。此外孔径0.8-1.8μm的石棉板滤器孔径1.5- 1.7μm的白陶土滤柱，也可作滤过细菌用，但由于它们存在一些缺点，所以实际使用不多。
（五）辐射灭菌法 辐射灭菌是应用γ射线杀菌的方法。γ射线通常可由放射性同位素如Co60产生。辐射灭菌的特点是可不升高的产品的温度，特点用于某些不耐热的灭菌，穿透性强，γ射线适用于较厚样品的灭菌，现已成功地应用于某些物质如维生素类、抗菌素、激素、肝素、羊肠线、医疗器械等物质的灭菌。包装的产品也可灭菌而大大减少了污染的机会。灭菌剂量一般用2.5兆拉得（Megarad），此法，已为《英国药典》（1969）日本药典Ⅸ所收载。
辐射灭菌，设备费用高，某些药品经辐射灭菌后，有可能效力降低，产生毒性物质或发热性物质，且溶液不如固体稳定，同时要注意全防护问题。
（六）微波灭菌法、高速风灭菌法 通常所谓微波，是指频率在300兆赫到300千兆赫之间的电磁波。水可强烈地吸收微波，使极性分子转动，由于分子间的摩擦而生热。热是在被加热的物质内产生的，所以加热很均匀，并且升温迅速。同时，由于微波可穿透介质较深，所以在一般情况下，可以作到表里一致地均匀加热。微波所以用于水性注射的灭菌，主要是由于其产生热效应的缘故。
微波灭菌法含菌量高达350万个大肠杆菌的生理盐水混悬液，密封在1－2ml的安瓿中，经3－5千瓦功率，2450兆赫的微波作用15秒钟以上，安瓿温度接近110℃左右时，可将细胞细菌全部杀灭。金黄色葡萄球菌与此结果近似，枯草杆菌芽胞，含量为6万－8万个时，液温必须达到140℃，保持20秒钟以上。才能彻底杀灭，含2，000－3，000个青菌胞子的生理盐水混悬液，在3－4千瓦微波功率作用下，液温达到120℃以上，经20－25秒钟，即彻底杀灭。经过微波灭菌后的安痛定、维生素、维生素C、速尿、庆大霉素、卡那霉素注射液。除维生素C的溶液色泽有部分变黄外，其他五种的色泽、pH和主要成份含量都无明显变化。宇野等还比较了微波灭菌与高蒸气灭菌对17种化学药物稳定的影响，认为对高压蒸气灭菌稳定的药物，使用微波灭菌时无变化，而对高压蒸气灭菌不稳定的药物如维生素C，阿司匹林等用微波灭菌，则比较稳定，其分解程度降低。此法由于存在破损率高，灭菌不完全及劳动保护等问题，还有待进一步研究。
高速风灭菌法，应用的风速为30－80m／秒，风温度高为190℃，由于降低了安瓿周围的滞流层的厚度，使安瓿内液体迅速升温。2ml的安瓿注射液应用此法，能于3分外的短时间内升高至140℃，对于耐热性高的嗜热脂肪芽胞杆菌，液温度达到130℃以上，就呈现显著灭菌效果。与热压蒸气灭菌法比较，不但具不同等以上的灭菌效果，并使注射液变质较少。因此，作者认为高速热风菌法，对于小容量安瓿注射液的灭菌极为不利。
此外还有超音波灭菌法，仅用于疫苗制品。
