药物分析：常用定量分析法与应用——酶法

　　2）荧光分析法：它的原理是，如果酶反应的底物与产物之一具有荧光，那么荧光变化的速度可代表酶反应速度。
　　应用此法测定的酶反应有两类：一是脱氢酶等反应，它们的底物本身在酶反应过程中有荧光变化，例如NAD（P）H的中性溶液发强的蓝白色荧光（460nm），而NAD（P）＋则无。另一类是利用荧光源底物的酶反应，例如可用二丁酰荧光素测定脂肪酶，二丁酰荧光素不发荧光，但水解后释放荧光素。荧光分析法测得的酶活性水平通常以单位时间内荧光强度的变化（AF／At）表示。荧光测定法的主要缺点是，荧光读数与浓度间没有确切的比例关系，而且常因测定条件如温度、散射、仪器等而不同，所以如果要将酶活性以确定的单位表示时，首先要制备校正曲线，根据这曲线再进行定量。
　　荧光分析法的优点是灵敏度极高，它比光吸收测定法还要高2～3个数量级，因此特别适于酶量或底物量极低时的快速分析。
　　3）旋光度法：某些酶反应过程常伴随着旋光变化，在没有其它更好的方法可用时，可考虑用旋光度测定法。
　　4）酶偶联测定法：所谓酶偶联法是应用过量、高度专一的“偶联工具酶”，使被测酶反应能继续进行到某一可直接、连续、简便、准确测定阶段的方法。以和光学检测法相偶联的分析法为例：
　　①被测酶反应的产物是某脱氢酶的底物。在这种情况下，可向反应测定系统中加入足够量的相应的脱氢酶和辅酶，使反应继续进行，然后通过NAD（P）H特征吸收变化而加以测定。例如，己糖激酶（HK）的测定就可在过量的葡萄糖－6－磷酸（G-6-P）脱氢酶　（G6PDH）和NADP＋存在的条件下进行：
　　　（反应式）
　　大约有50种左右的脱氢酶可以利用NAD＋和NADH，20多种脱氢酶能利用NADP+和NADPH用作偶联指示酶。
有些情况下，被测反应不能直接和上述脱氢酶反应连起来，此时可再插入一个起联结作用的辅助酶反应。例如为了测定肌激酶就可用这样的系统：
　　（反应式）被测反应
　　其中PEP、Pry和L分别代表磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸和乳酸；AMP、ADP和ATP分别为一磷酸、二磷酸和三磷酸腺苷。
②被测反应物和其他有光学性质改变的酶反应偶联。 如腺苷酸脱氨酶在催化AMP脱氨过程中对265nm的光伴随有吸收度的降低，此酶专一于AMP，不作用ADP和ATP，因此在测定某些合成酶或激酶反应时，它可用作偶联指示酶；肌激酶的测定也可被利用：
　　应用酶偶联测定法最重要的是加入的偶联工具酶应该高度纯净、专一而且过量，使测得的反应速度和酶浓度间有线性关系。至于偶联指示　　酶的用量一般应为被测酶的100倍左右。
　　5）其他：其他检测法有电化学测定法；离子选择性电极测定法适用于产酸反应中pH变化的测定；放射化学法的特点是灵敏度极高，可直接用于酶活性测定，缺点是操作繁而费时。
　　4．测定过程中应注意的问题
　　（1）产物的测定：和一般化学反应一样，酶反应速度可用单位时间内反应物（底物）的减少或产物的增加来表示：
　　其中s和p分别代表底物或产物浓度，t为时间。一般情况下，产物和底物的改变量是一致的。但是由于反应系统中使用的底物往往是足够过量的，而反应时间通常又很短，底物的减少量仅为总量的很小的百分数，因此测定不易准确；反之，产物从无到有，只要测定方法灵敏，准确度可以很高，故以分析产物为好。
　　（2）反应速度的测定：反应速度可以单位时间内底物的变化量表示。如果将测得的产物或底物变化量对时间作图，可获得“酶反应进程曲线”，这条曲线的斜率就代表酶反应速度。
　　大多数酶的反应进程曲线表明，在酶反应的最初阶段里，底物或产物的变化量一般随反应时间而线性地增加，反应速度恒定；但是反应时间延长，这条曲线会逐渐地弯曲下来，斜率发生改变，反应速度下降。其原因是，底物浓度在下降，产物在增加，逆反应从无到有逐渐变得显著起来；同时酸、碱、热等也在慢慢地使酶失效。因此，这种情况下测得的反应速度已是一种表观的、多种因素影响下的综合结果，不能代表酶的真正活性。真正能代表酶催化活性的是反应初始阶段的速度，即反应初速度。
　　要求得初速度，一般先要给一条酶反应进程曲线，并取其直线线段的斜率代表酶反应初速度；如果这条直线线性不明显，那末就应沿曲线的最初部分画出通过零点或外推到零点的切线，并以这条切线构成的斜率代表酶反应初速度。
　　进程曲线可以通过连续测定得到，也可通过在间隔时间取样测定绘制，它至少应由三个时间点组成；零时点、适当选择的时间间隔（取决于具体的反应和测定方法）以及二倍于这个间隔的点。并且要求在这种时间范围内反应量不超过底物总量的20％。
　　（3）测定要达到的要求：酶活力测定的目的，就是要通过酶反应速度的测定，求得酶的浓度或含量，因此，测得的反应速度必须和酶浓度间有线性的比例关系，这也是检验酶反应和测定系统是否适宜、正确的标准。
　　要达到上述测定要求，最基本的是必须测定反应初速度。图可以很好地说明二者的关系，（a）是在不同酶浓度条件下得到的反应进程曲线，可见酶浓度不同，反应速度下降的先后、快慢各不相同；如果将这些曲线在不同时间测得的反应速度相对酶浓度作图，就可得到　　　　（b）所示的酶浓度曲线，可见只有在反应时间to测得的反应速度和酶浓度间具有合乎要求的线性比例关系；而在t1和t2（t2〉t1＞to）得到的结果则不一定这样，反应时间越长，这种偏离也越大。
（图13酶反应进程曲线与酶浓度曲线的关系）
　　所以在通常的酶活力测定时，总要先制备两条曲线：酶反应进程曲线和酶浓度曲线。从前者求得反应初速度，根据初速度绘制酶浓度曲线，并通过后者来检验酶反应测定系统是否适宜。
　　（二）酶分析法
　　酶分析法是一种以酶为分析工具（或试剂）的分析方法。分析的对象可以是酶的底物、辅酶活化剂甚至酶的抑制剂。在进行这类分析时，先要根据分析对象选择适宜的“工具酶”，然后再通过酶反应的测定，并借助相应的校正曲线来测定它们的浓度或含量。在上述几种检测对象中，除了底物可以采用总变量分析法外，其他都只能用动力学分析法。
　　1．动力学分析法这种分析法的原理是：通过条件控制，分别使底物、辅酶活化剂或抑制剂的浓度在酶反应中起决定反应速度的主导作用，这时酶反应速度和上述相应因素的浓度间将具有确定的比例关系，这样测定酶反应的速度就可求出它们的浓度。酶分析法采用的条件和酶活力测定法的条件基本相同，但其所用的酶量必须一定．被测物以外的其他反应成分均须保证处于恒定和最适。以下分别简述各种物质测定应注意的问题。
　　（1）被测物是酶的底物：当底物浓度［S］〈km时，酶反应相对底物而言具有一级反应性态，即酶反应速度与底物浓度成正比，u＝k·［S］，因此测定酶反应速度可以得知其浓度。