药物分析：常用定量分析法与应用——酶法

　　（2）被测物是辅酶：需要NAD（P）、coA之类辅酶的反应可看作是双底物反应，这些辅酶可看作是底物之一。当另一类底物浓度足够高时，反应变为单底物反应；那么反应速度将与其成正比。以CoA的测定为例，它是α-酮戊二酸脱氢酶的辅酶：
此反应可通过340nm吸收度的变化来测定，当另外二种底物处于足够高的浓度时，反应速度与CoA的浓度成正比。
　　（3）被测物为活化剂：当其他条件最适且一定时，活化剂在低浓度范围内，酶反应速度随活化剂浓度增大而升高，并在一定范围内具有线性比例关系。但是用动力学方法测定时有两个问题应注意：①活化剂浓度超过一定水平后常导致抑制；②对于某一种酶，相似的离子往往也能表现出活化作用，因此测定不专一，易受到干扰。
　　（4）被测物是抑制剂：不可逆抑制剂对酶反应产生的抑制程度随抑制剂浓度呈线性增加，而且酶反应的最终抑制程度由抑制剂的绝对量决定；可逆抑制剂在底物浓度一定时，在低的抑制剂浓度范围内，酶反应速度随抑制剂浓度升高呈线性降低。因此均可以用动力学方法测定，而且测定往往极为灵敏。例如，胆碱酯酶能用于检测10－l0g水平的有机磷化合物。这种测定应注意的是：某些抑制剂能抑制多　　种酶；而有些酶能被几种相似的抑制剂所控制，因而如果“工具酶”选择不当，就易受到干扰。
　　对酶分析法来说，在建立了适宜的反应和测定系统后，还必须制备一条酶反应速度相对于相应的被测物浓度的标准曲线，以便对未知样品的量进行检测。值得强调的是，在测定未知样品时，所采用的反应、测定系统和制备标准曲线时所用的系统应完全相同，而且待测样品的浓度还应控制在这一曲线范围以内。
　　2．总变量分析法又称为平衡法或终点法。这是根据被测物质的性质，选择适宜的分析工具酶对该物质进行作用，然后在反应完成后，借助物理化学方法测出其总变化量，并参考反应的平衡点，计算出被测物的实际含量或浓度的一种分析方法。仅适用于底物物质的测定，应用时应考虑工具酶的用量与反应的平衡点。
　　终点法要获得好的测定结果，重要条件是：①被测底物的浓度应很小，并控制反应于1级反应水平。因为这样可以使反应速度达到平衡点；防止过多的产物生成，避免逆反应。②其它因素应尽量处于最适水平，双底物反应的另一底物应具有足够高的浓度。③酶的用量要高，以保证反应较快地达到终点。
　　酶比较昂贵，因此有一个适宜的用量问题。一般而言，工具酶用量可控制在1～2 km单位（U／m1）左右。而终点法的测定时间多控制在2～10min。
　　（三）酶分析法应用示例
　　示例一 胰蛋白酶效价测定
　　本品系自牛、羊、猪的膜中提取的蛋白水解酶。按干燥品计算，每1mg的效价不得少于2500单位。
胰蛋白酶能专一地作用于赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸的羧基组成的肽键，酰胺键及酯键，其水解速率为酶键〉酰胺键＞肽键。也可水解间位经基苯甲酸酶及脂肪酸酶，以及变性蛋白如酶蛋白、血红蛋白。因此可选用酪蛋白或含有碱性氨基酸的酰胺、酶等作为底物测定其酶活力。因酶蛋白可被很多蛋白水解酶水解，缺乏专一性，故目前均采用专属性较离的N-苯甲酰酰－L精氨酸乙酯（BAEE）作为本品的底物。
　　供试品溶液的制备 精密称取本品适量，用0.001mol/L盐酸液溶解并制成每1m1中含50～60胰蛋白酶单位的溶液。
　　底物溶液的制备取N-苯甲酰-L精氨酸乙酯盐酸盐85.7mg，加水溶解使成100ml，作为底物原液；精密量取10ml，用磷酸盐缓冲液（取0.067mmol/L磷酸二氢钾溶液13ml与0.067mol／L磷酸氢二钠溶液87ml混合，pH7.6）稀释成100ml，恒温于25.0±0.5℃，在253nm波长处，以水做空白，测定吸收度，必要时可用磷酸盐缓冲液（pH7.6）或上述底物原液调节，使吸收度在0.575～0.585之间，作为底物溶液。底物溶液应在制成2h内使用。
　　测定法取底物溶液3.0ml与0.001mOl／L盐酸液0.2ml，混匀，作为空白。另取供试品溶液0.2ml与底物溶液（预热至25±0.5℃） 3.0m1，立即计时并摇匀，比色池内的温度应保持在25士0.5℃，在253nm波长处，每隔30s读取吸收度，共5min。以吸收度为纵坐标，时间为横坐标，作图；每30s吸收度的改变应恒定在0.015～0.018之间，呈线性关系的时间不得少于3min。若不符合上述要求，应调整供试品溶液的浓度，重新测定。在上述吸收度对时间的关系图中，取呈直线部分上的吸收度，按下式计算：
（公式）
　　式中P：为每1mg胰蛋白酶供试品中含胰蛋白酶的单位数；A1为直线上终止的吸收度；A2为直线上开始的吸收度；T为A1至A2读数的时间（min）；W为测定液中含供试品的mg数；0.003为在上述条件下，吸收度每分钟改变0.003，即相当于1个胰蛋白酶单位。
影响效价测定的因素
　　（1）酶浓度：在固定底物浓度、反应温度、pH等条件下，调整反应液的酶浓度是效价测定的关键，酶浓度过高或过低都不能使反应速率保持恒定，最佳的测定浓度为50～60IU／ml。
　　（2）温度：温度变化对酶促反应速率较敏感，温度每升高1℃，活力单位约增高5％，反之，则下降。为准确控制反应温度，除调节水浴　　温度或室温外，由于在测定时受仪器散热和光照等影响，故必须随时测量比色池内反应物的温度，以保证测定结果的准确性。
　　（3）底物：因BAEE酶键易水解，其水溶液不稳定，故该底物溶液应在配制后3h内使用BAEE底物测定本品酶活力，操作简便，准确度高，RSD一般可控制在5％以下。
示例二 胃蛋白酶的活力测定［3］
　　本品系自猪、羊或牛的胃粘膜中提取的胃蛋白酶，具有催化蛋白质水解的能力。在实验条件下，胃蛋白酶催化血红蛋白水解生成不被三氯醋酸所沉淀的氨基酸。利用水解产物中芳香氨基酸如苯丙氨酸、酶氨酸和色氨酸有紫外吸收，用紫外分光光度法直接测定，并计算出本品的酶活力。每1g检品中含蛋白酶活力不得少于 3800单位。
对照品溶液的制备 精密称取经105℃干燥至恒重的酪氨酸适量，加盐酸溶液（取1mol／L盐酸溶液65时，加水至1000ml）制成每1ml中含0．5mg的溶液。
　　供试品溶液的制备 取本品适量，精密称定，用上述盐酸溶液制成每1ml中约含0.2～0.4单位的溶液。
　　测定法取试管6支，其中3支各精密加入对照品溶液1时，另3支各精密加入供试品溶液1ml，置37土0.5℃水浴中，保温5min，精密加入预热至37± 0.5℃的血红蛋白试液5ml，摇匀，并精确计时，在37土0.5℃水浴中反应10min。立即精密加入5％三氯醋酸溶液5ml，摇匀，滤过，取续滤液备用。另取试管2支，各精密加入血红蛋白试液5ml，置37±0.5℃水浴中保温10min，再精密加入5％三氯醋酸溶液5ml，其中1支加供试品溶液 1ml，另1支加上述盐酸溶液1ml，摇匀，滤过，取续滤液，分别作为供试品和对照品的空白对照，照分光光度法，在275nm的波长处测定吸收度，算出平均值As和A，按下式计算：
（公式）
　　式中：Ws为1ml对照品溶液中含酶氨酸的量（μg）； W为供试品取样量（g）； n为供试品的稀释倍数；A，As分别为对照品溶液及供试品溶液吸收度的平均值；181.19为酪氨酸的分子量。
　　在上述条件下，每分钟能催化水解血红蛋白生成1μmol酶氨酸的酶量，为一个蛋白酶活力单位。
　　本法是通过酶促反应动力学和正交试验研究，确定酶和作用物的浓度、反应时间、温度和pH等最佳反应条件而建立的，具有灵敏度高、操作简便等优点。测定时，滤液须澄清，否则将影响结果的准确度及精密度。
影响效价测定的因素