☆ ☆考点4：高效液相色谱法
1．基本概念
使用高效固定相，以液体为流动相并采用高压泵输送的在线检测色谱法称为高效液相色谱法（HPLC）。
高效液相色谱法是在经典液相色谱基础上发展起来的一种液相色谱方法。具有分离效能高、分析速度快、应用范围广、流出组分容易收集等特点，是在药品检验中应用非常广泛的一种仪器分析方法。
2．基本原理
高效液相色谱法的速率理论方程：H＝A＋Cu
高效液相色谱法与气相色谱法的速率理论方程的区别：
（1）忽略了纵向扩散相（因为液体的黏度比气体大得多，且柱温为室温）；
（2）Cu的内涵不同。影响柱效的主要因素为A和Cu。
3．高效液相色谱法的分类
（1）吸附色谱法：是固定相为固体吸附剂的高效液相色谱法。固定相是吸附剂（常用硅胶）；流动相为烷烃。溶剂系统的极性越强，洗脱能力越强，组分的tR也越小；组分的极性越强，被固定相的吸附也越强，tR越长。
（2）分配色谱法：固定相为液体（常被键合在载体上，称为化学键合相）。组分因在两相中分配系数的差异而被分离。优点为在pH2～8间稳定、不流失、载样量大、热稳定性好。
按照固定相和流动相的极性，分配色谱法又可分为：
①正相色谱法：流动相极性小于固定相极性。常用氰基和氨基柱。极性小的组分由于K值较小，所以先流出，极性大的组分后流出。
②反相色谱法：流动相极性大于固定相极性。常用非极性固定相是十八烷基硅烷键合硅胶（ODS或C18柱），流动相常用甲醇-水或乙腈-水。极性大的组分先流出。是应用最广泛的高效液相色谱法。
③反相离子对色谱法：反相色谱法中加入离子对试剂，使被分析离子形成离子对的色谱方法。
④离子抑制色谱法：通过调整流动相的pH值，抑制组分的解离的色谱法。
4．常用的固定相
（1）硅胶：用于吸附色谱法。
（2）化学键合相：用于分配色谱法。可分为非极性键合相和极性键合相。
（3）键合型离子交换剂：用于离子交换色谱法。
5．高效液相色谱仪
（1）高压输液泵：用于输送流动相。要求流量恒定，且可以自由调节，耐高压，耐腐蚀，适于梯度洗脱等。
（2）色谱柱：由柱管和固定相组成，采用匀浆法高压装柱。按规格可分为分析型和制备型两种。
（3）进样阀：目前使用的均为六通进样阀，进样量准确、重复性好。
（4）检测器：常用的有紫外检测器、荧光检测器、差示折光检测器及电化学检测器等。
《中国药典》正文中各品种项下规定的条件，除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种，但要求达到系统适用性试验的要求。
6．应用
（1）鉴别：供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液一致。
（2）杂质检查：有内标法加校正因子测定供试品中杂质的含量；外标法测定供试品中杂质的含量；加校正因子的主成分自身对照法；不加校正因子的主成分自身对照法以及面积归一化法等。
（3）含量测定：含量测定方法同气相色谱法，有外标法和内标法等。
☆ ☆☆☆考点5：色谱系统适用性试验方法
色谱法由于易受实验条件的影响，所以在测定前需做系统适用性试验，以检查色谱系统是否符合要求。《中国药典》气相色谱法和高效液相色谱法的系统适用性试验内容如下。
1．色谱柱的理论塔板数（n）
n＝5.54（tR/Wh/2）2
色谱柱的理论塔板数是根据保留时间（tR）和半高峰宽（W1/2）按塔板理论的公式来计算的。色谱柱的理论塔板数高，表明色谱峰尖锐，有利于分离度、重复性的提高。理论塔板数的测定方法为：在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主要成分或内标物质的保留时间tR和半峰宽（Wh/2）。
2．分离度（R）
分离度表示枢邻两峰的分离程度。定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R）的计算公式为：
式中，tR2--相邻两峰中后一峰的保留时间；tR1--相邻两峰中前一峰的保留时间；W1及W2--此相邻两峰的峰宽。除另有规定外，分离度应大于1.5。
3．重复性（RSD）
取各品种项下的对照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%。也可按各品种校正因子测定项下，配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成三种不同浓度的溶液，分别进样3次，计算平均校正因子，其相对标准偏差也应不大于2.0%。
4．拖尾因子（T）
为保证测量精度，特别当采用峰高法测量时，应检查待测峰的拖尾因子（T）是否符合各品种项下的规定。拖尾因子计算公式为：
式中，W0.05h--峰高0.05处的峰宽；d1--峰极大至峰前沿之间的距离。除另有规定外，T应在0.95～1.05之间。
☆ ☆☆☆考点6：电泳法
1．定义
在电场作用下，依据各组分之间淌度的不同而实现分离的方法，称为电泳法。
2．基本原理
在电场中，带电粒子的电泳迁移速度（v）为：
v＝μE
式中，μ--电泳淌度（或电泳度）；E--电场强度（电压梯度）。
在相同的电场强度下，两组分分离的程度取决于二者淌度之差，而电泳淌度与组分的荷质比成正比。
电泳所用的支持物如滤纸在溶液中带负电，而使接近其表面的缓冲液带正电，且形成双电层。在电场的作用下，带正电的缓冲液整体向负极移动，形成电渗。电泳分离后各组分的相对位置是由组分的电泳泳动和缓冲液的电渗共同决定的。
3．影响电泳分离的条件
（1）缓冲液的pH值和离子强度。pH直接影响组分的荷电情况，是电泳分离的最重要条件，因此电泳时需用缓冲液维持恒定的pH。如果离子强度太小，则缓冲容量不足，且区带易扩散；若太大，则因受相反电荷离子的牵制力，组分移动速度慢，且发热严重，也使区带扩散。
（2）电场强度。电场强度越大，淌度越大，分离也越完全。但若大于20V/cm时，因发热使蒸发剧烈，缓冲液浓缩，电流增大，甚至会将滤纸等烧断。
（3）样品浓度。通常以1%为宜。太浓会拖尾，太稀则定量测定结果精密度差，甚至不易检出。
4．电泳仪
电泳仪由直流稳压电源和电泳室两部分组成。电源应能供给一个可以调节的稳压直流电，常用电泳一般在100～500V；高压电泳一般在500～10000V。
常用的水平电泳室装置如上图，包括两个可盛缓冲液的电泳槽（A），一个可以密封的（玻璃或相应材料）盖（B）；两侧的电泳槽均用有机玻璃（或相应材料）板分成两部分；外格装有直径0.5～0.8cm的铂电极（D）；里格为可放滤纸或凝胶（E）的有机玻璃电泳槽架（F），此架可以从槽中取出；两侧电泳槽A内的铂电极D经隔离导线穿过槽壁与电源相连。
5．电泳法的分类
（1）纸电泳法。以色谱滤纸为支持物，枸橼酸盐缓冲液（pH3.0）为电泳缓冲液；可以用湿点法或干点法点样；电场强度为18～20V/cm；电泳时间约105分钟；洗脱法进行含量测定。
（2）醋酸纤维素电泳法。主要用于测定蛋白质相对百分含量。以醋酸纤维素薄膜为支持物，巴比妥缓冲液（pH8.6）为电泳缓冲液；条状点样；电场强度为10～20V/cm；电泳区带距离以4～5cm为宜；用氨基黑染色液染色；洗脱法或扫描法进行含量测定。
（3）琼脂糖凝胶电泳法。以琼脂糖制成厚度约3mm的凝胶薄层为支持物；醋酸-锂盐缓冲液为电泳缓冲液；电场强度约30V/cm（电流强度1～2mA/cm）；电泳时间约20分钟；用苯胺蓝溶液染色；洗脱法进行含量测定。
（4）聚丙烯酰胺凝胶电泳法。装置通常由稳流电泳仪和圆盘或平板电泳槽构成。以聚丙烯酰胺凝胶（制好于10cm×0.5cm的玻璃管中）为支持物；以三羟甲基氨基甲烷-甘氨酸缓冲液（pH8.3）为电极缓冲液；起始电流每管为1mA，数分钟后为2～3mA；电泳至溴酚蓝指示液移至玻璃管底部1cm处；用考马斯亮蓝G250染色液染色，7%醋酸溶液脱色；扫描法测定含量，或置灯下观察，与标准品比较。用相对迁移率进行比较：
（5）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法。用于测定蛋白分子量。除另有规定外其仪器装置和操作法同聚丙烯酰胺凝胶电泳法，以含有十二烷基硫酸钠（SDS）的磷酸盐缓冲液为电泳缓冲液，电泳电流为每管8mA，用考马斯亮蓝R250染色液染色，醋酸乙醇溶液脱色，按下式计算相对迁移率：
从已知分子量的标准蛋白的分子量的对数和相对迁移率所作的标准曲线中求出供试品的分子量。
6．毛细管电泳法
毛细管电泳法是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的分析方法。
毛细管电泳的分离模式主要有毛细管区带电泳（CZE）、毛细管凝胶电泳（CGE）、胶束电动毛细管色谱（MEKC）、亲和毛细管电泳（ACE）、毛细管电色谱（CEC）、毛细管等电聚焦电泳（CIEF）和毛细管等速电泳（CITP）。
毛细管电泳法的系统适用性试验和测定法与高效液相色谱法的相同。
