色谱法
☆ ☆考点1：色谱法总论
1．色谱法
是一种物理或物理化学分离分析方法。即先将混合物中各组分分离，而后逐个分析，因此是分析混合物最有力的手段。色谱法具有高灵敏度、高选择性、高效能、分析速度快及应用范围广等优点，在各国药典中广泛用作药品定性鉴别、纯度检查和含量测定的法定方法。《中国药典》(2005年版)收载的色谱法有薄层色谱法（TLC）、气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）。
2．分类
色谱法可以从不同的角度进行分类，按流动相与固定相的分子聚集状态分类，若流动相是气体和液体，可分为气相色谱法和液相色谱法；按固定相分为固体或液体，气相色谱法又可进一步分为气-固或气-液色谱法；液相色谱法又可分为液-固或液-液色谱法。按操作形式可分为柱色谱法、平面色谱法、电泳法等。按分离机制可分为分配色谱法、吸附色谱法、离子交换色谱法、空间排阻色谱法及亲和色谱法等类型。
3．色谱过程
是物质分子在相对运动的两相（固定相和流动相）间分配平衡的过程，可以用分配系数（K）和容量因子（k）来描述。
（1）分配系数：组分在固定相和流动相之间分配平衡时的浓度之比称为分配系数。即：
K＝CS/Cm
式中，CS--平衡时组分在固定相中的浓度；Cm--平衡时组分在流动相中的浓度。
分配系数与组分、固定相和流动相的性质及温度有关。色谱法是利用组分在固定相和流动相之间分配系数的差异而实现分离的。
（2）容量因子：又称为质量分配系数，即达到分配平衡后，组分在固定相和流动相中的质量之比：
k=WS/Wm
式中，WS--平衡时组分在固定相中的质量；Wm--平衡时组分在流动相中的质量。
容量因子与分配系数有如下关系：
k=CSVS/CmVm=KVS/Vm
式中，VS--固定相的体积；Vm--流动相的体积。
容量因子不仅与组分、固定相和流动相的性质及温度有关，而且还与两相的体积有关。在实际工作中，容量因子比分配系数更容易测定，因此常用容量因子代替分配系数。组分的容量因子不等是色谱分离的先决条件。
4．色谱过程方程
即保留时间与分配系数（或分配比）之间的关系：
tR=t0（1+KVS/Vm）=t0（1+k）
式中，tR--组分的保留时间；t0--死时间。色谱过程方程是色谱法的最基本公式之一。
☆ ☆☆☆考点2：薄层色谱法
1．基本原理
将固定相均匀地涂布在具有光洁表面的玻璃、塑料或金属板上形成薄层，在此薄层上进行色谱分离的方法称为薄层色谱法（TLC）。
（1）吸附薄层色谱：固定相为吸附剂的薄层色谱法称为吸附薄层色谱法。
分离原理：组分在吸附剂与异型剂之间发生连续不断的吸附、解吸、再吸附、再解吸，产生差速迁移得到分离。例如：将A、B两组分的混合溶液点在薄层板的一端，在密闭的容器中用适当的流动相（展开剂）展开。此时A、B不断地被吸附剂所吸附，又被展开剂所溶解而解吸，且随展开剂向前移动。由于吸附剂对A和B具有不同的吸附能力，展开剂也对A和B有不同的溶解、解吸能力，即KA≠KB，因此当展开剂不断展开，A、B在吸附剂和展开剂之间发生连续不断的吸附、解吸，从而产生差速迁移得到分离。K值越大的组分随展开剂移动的速度越慢。如下图：
（2）比移值：组分的迁移距离（l）与展开剂的迁移距离（l0）之比称为比移值（Rf）。
Rf＝l/l0
式中，l--原点至某组分斑点中心（质量重心）的距离；l0--原点至展开剂前沿的距离。实践中，Rf值的最佳范围是0.3～0.5，可用范围是0.2～0.8。比移值描述组分斑点的位置，是薄层色谱的基本定性参数。
影响比移值的因素主要包括：①被分离物质的结构和性质。在硅胶薄层板上，极性较强的组分Rf值较小。②薄层板的性质。吸附剂的活性越强，其吸附作用就越强，使组分的Rf值越小。③展开剂的性质。极性越强的展开剂与吸附剂的作用越强，使组分与吸附剂的作用相对减弱，Rf值增大。④展开室内的展开剂蒸气饱和程度对Rf值也有较大影响。
（3）分离度：两相邻斑点中心距离与两斑点平均宽度（直径）的比值称为分离度或分辨率。分离度是衡量TLC系统好坏的参数。
R=2d/（W1＋W2）
式中，d--两斑点中心间的距离；W1--斑点1的宽度；W2--斑点2的宽度。
2．操作方法
（1）吸附剂和展开剂。常用吸附剂有硅胶、氧化铝、聚酰胺，还有硅藻土、纤维素等。硅醇基是使硅胶具有吸附力的活性基团，水能与硅胶表面羟基结合而使其失去活性。硅胶的含水量越高，则活性越低，吸附力越弱。硅胶在105～110℃加热30分钟，使硅胶吸附力增强的过程称为“活化”。
薄层色谱常用硅胶有硅胶H（不含黏合剂）、硅胶G（含黏合剂和煅石膏）和硅胶HF254（不含黏合剂而含有荧光剂）等。同样，氧化铝也分为氧化铝G、氧化铝H和氧化铝HF254等。
极性较强的组分选择极性较强的展开剂，极性较弱的组分选择极性较弱的展开剂。展开剂的选择要使组分的Rf值在0.3～0.5范围内为宜。
（2）薄层板的制备。将1份固定相和3份水在研钵中研磨，均匀涂于玻璃板上，室温晾干后于110℃加热30分钟，置干燥器中备用。
（3）点样与展开。用点样器点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底2.0cm，样点直径以2～4mm为宜，点间距离为1.5～2.0cm，点样时勿损伤薄层表面。将点好样品的薄层板放入层析缸的展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层底边0.5～1.0cm（切勿将样品浸入展开剂中），密封室盖，待展开至规定距离（一般为10～15cm）后，取出薄层板，标记好前沿，晾干。
薄层色谱的展开方式多为上行法，还有下行展开、双向展开、多次展开等多种方式。
（4）斑点的定位。进行定性或定量前都必须确定组分在薄层板上的位置，即定位。定位的方式有直接目视法、显色法、紫外灯下观察荧光法、荧光淬灭法等。
3．应用
（1）鉴别。比较供试液与对照液的比移值。将两种溶液点于同一薄层板上，展开后比较两者的Rf，应一致。
（2）杂质检查
①杂质对照品比较法。配制一定浓度的供试品溶液和规定限度浓度的杂质对照品溶液，点样、展开、检测后比较，供试品中相应杂质斑点的颜色应不深于杂质对照品的斑点颜色。
②高低浓度对比法（主成分自身对照法）。先配制一定浓度的供试品溶液，然后稀释一定倍数得到另一低浓度溶液，作为对照溶液。将两种溶液点样，展开后，比较所得斑点。供试品溶液中杂质斑点的颜色不得深于对照溶液的主斑点（有的还规定供试品溶液杂质斑点个数不得超过几个）。
③检测限法。配制一定浓度的供试品溶液，点样、展开后，检查。要求供试品溶液中不得出现杂质斑点。
