☆ ☆考点2：荧光分析法
某些物质受紫外光或可见光照射后，能发出波长较激发光长的荧光。利用物质的荧光光谱进行定性、定量分析的方法称为荧光分析法。
1．基本原理
物质的分子吸收紫外光或可见光后，由电子基态能级跃迁至激发态能级。处于激发态的分子不稳定，通过各种方式失去能量，返回基态。若分子首先通过碰撞和系统内转换等方式失去部分能量，下降至电子第一激发态的最低振动能级，然后再发射一定波长的光返回电子基态的任一振动能级，则被发射的光称为荧光。显然，荧光的能量小于激发光能量，波长则长于激发光。荧光的平均寿命很短，除去激发光源，荧光立即熄灭。
记录某一物质溶液在不同波长激发光照射时的发射光强度，可得到该物质的荧光激发光谱；选择激发光谱中荧光强度最强的激发波长作光源，记录上述溶液在不同荧光波长时的发射光强，就得到了该物质的荧光发射光谱。不同结构的化合物产生不同的荧光激发光谱和荧光发射光谱，据此可对物质进行定性分析。
当激发光的波长、强度，测定用溶剂、温度等条件一定时，物质在低浓度范围内的荧光强度与溶液中该物质的浓度成正比。这就是荧光分析法用于物质定量分析的依据。
2．荧光分光光度计
荧光分光光度计的工作原理可以用以下的方框图来表示：
（1）激发光源。荧光激发光源常用汞灯或氙灯，与紫外-可见分光光度计中所用钨灯和氢灯相比，这些灯强度更大。
（2）单色器。荧光分光光度计常装有两个光栅单色器，一个是激发单色器，另一个是发射单色器。
（3）样品池。用低荧光的玻璃或石英材料制成。和吸收池不同，荧光测定用样品池四面都透光，从样品池出来的荧光方向与激发光源成直角，这样可在背景为零时检测微小的荧光信号，因而荧光分析法的检测灵敏度高于一般的分光光度法。
（4）检测器。常用光电倍增管接受发射光，再将其转化为电信号、放大、输出。
3．应用
虽然很多化合物对200～400nm区域的光有吸收，但只有一些具有特殊π-π共轭结构的分子才能发射出荧光。《中国药典》应用荧光法对这些药物进行分析。
（1）鉴别。荧光素钠的水溶液显强烈的荧光，加酸使成酸性后，荧光即消失，加碱使成碱性后，荧光又显出，据此对该药物进行鉴别。马来酸麦角新碱的水溶液显蓝色荧光，双嘧达莫的乙醇溶液显绿色荧光，《中国药典》利用这些药物显荧光的特点，对其进行鉴别。
一些化合物本身不发射荧光，但经过一些特殊处理后也能采用荧光法鉴别。如维生素B1的鉴别。
（2）含量测定。由于不易测得绝对荧光强度，故荧光分析法都是在一定条件下，采用对照品比较法测定含量，按下式计算供试品浓度：
式中，Ci，Cr--供试品溶液和对照品溶液的浓度；Ri，Rr分别为供试品溶液和对照品溶液的荧光读数；Rib、Rrb--供试品溶液和对照品溶液试剂空白的荧光读数。
较之紫外-可见分光光度法，荧光分析法具有灵敏度高、选择性好的优点，但干扰因素多、线性范围窄限制了其广泛应用。目前，荧光分析法多用于需要高灵敏度和允许较大变异性的样品分析，如生物样品分析和小剂量制剂（如地高辛片）的分析。
☆ ☆☆☆☆考点3：红外分光光度法
1．基本概念
（1）红外光：波长（λ）为2.5～25μm（相应的波长λ为4000～400cm-1）范围内的光。
（2）波数（ν）：1cm中包含某一波长的光的个数。波数（ν）和波长（λ）互为倒数。
（3）红外吸收光谱：物质分子吸收红外光而产生的吸收光谱。
（4）红外分光光度法（IR）：利用红外吸收光谱对物质进行分析的方法。
（5）基频峰：振动能级由基态跃迁至第一激发态产生的吸收峰。是红外光谱上最主要的吸收峰。
（6）特征峰：鉴别官能团存在的峰，多为基频峰。
（7）相关峰：由一个官能团所产生的一组相互依存的特征峰。
（8）峰位：透光率峰谷对应的波数。
2．基本原理
（1）红外光谱的性质。分子由原子通过化学键连接。化学键两端的原子吸收红外光可引起分子振动和转动能级的跃迁，产生吸收光谱。红外光谱又称为分子的振-转光谱。分子的基本振动形式有两种，即伸缩振动（ν）和弯曲振动（δ、γ）。
（2）定性依据。红外光谱在药物分析中主要用于定性。不同分子具有不同的振动、转动形式和能级。因而具有不同的红外吸收光谱，根据吸收峰的峰位、峰强、峰形进行定性分析。
3．红外光谱仪
（1）色散型红外分光光度计的组成如下：
光源→吸收池→单色器→检测器→数据记录和处理
（2）光源：发射高强度、连续红外光谱的物体。常用的有能斯特灯和硅碳棒等。
（3）吸收池：用于放置气、液、固态的待测样品。固体样品多以KBr压片。
（4）单色器：将入射的复合红外光色散为单色光，再逐一由出射狭缝射出。色散元件目前主要用光栅。
（5）检测器：用于将红外单色光信号转变为电信号。目前常用的检测器有真空热电偶、高莱池等。
（6）记录器：将电信号记录并以图谱方式给出。
（7）仪器的校正：《中国药典》规定，以聚苯乙烯薄膜（厚度约0.05mm）为测试样品，绘制其红外光谱图，用2851cm-1、1601cm-1、1028cm-1、907cm-1处的吸收峰对仪器的波数进行校正。对仪器的分辨率的要求是：在3110～2850cm-1范围内应能清晰地分辨出7个峰，2924cm-1与2581cm-1吸收带的分辨深度不小于18%透光率，1601cm-1与1583cm-1吸收带的分辨深度不小于8%透光率；仪器的标称分辨率，除另有规定外，应不低于2cm-1。
4．红外光谱与物质结构的关系
如下图。红外吸收光谱的纵坐标一般为透光率（T%），横坐标为波数或波长（多用波数）。与紫外光谱不同，红外光谱中吸收峰的位置是透光率峰谷对应的红外光波数。
特征区的吸收峰由一些常见基团或化学键的振动产生，具有峰位恒定、峰相对稀疏、易于辨认和归属的特点。指纹区的吸收峰特点是峰细、密、具有人指纹一样的特征性。
下表列出了典型化学键的红外特征吸收峰（简称特征峰）。
5．应用
（1）鉴别。最常用。各国药典采用IR对原料药物（纯物质）进行鉴别，特征性强。方法：与标准图谱《药品红外光谱集》对比应一致。
值得注意的是，由于样品的测定方法、测定状态、含水量甚至研磨程度都会影响测得红外光谱的形状，因此进行光谱对比时，应考虑这些可能的影响因素。此外，同一物质晶型不同，往往产生有一定差异的吸收光谱。遇到这种情况，应先按该药品光谱图中备注的方法进行预处理，然后再绘制谱图、比较。
（2）检查。利用药物与其同质异晶杂质在特定波数处的吸收有显著差异，检查无效或低效晶型杂质。
