分光光度法
☆ ☆☆☆☆考点1：紫外-可见分光光度法
1．基本概念
（1）分光光度法：测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内对光的吸收度，对物质进行定性、定量分析的方法称为分光光度法。
（2）紫外光：波长在200～400nm范围内的光称为紫外光。
（3）可见光：波长在400～760nm范围内的光称为可见光。
（4）紫外-可见吸收光谱：物质吸收紫外线和可见光区的电磁波而产生的吸收光谱称为紫外-可见吸收光谱。
（5）紫外-可见分光光度法（UV）：利用紫外-可见吸收光谱进行定性和定量分析的方法，称为紫外-可见分光光度法。
紫外-可见分光光度法可用于药物的鉴别、检查和含量测定，是药品检验中应用非常广泛的一类仪器分析方法。《中国药典》附录收载有紫外分光光度法。
2．基本原理
（1）紫外-可见光谱的性质：分子的价电子吸收了光的能量，由低能量的基态转变为高能量的激发态的过程称为跃迁。被测物分子的价电子吸收紫外光或可见光，从低能级跃迁到高能级，产生吸收光谱。
（2）紫外-可见分光光度法的分析步骤：供试品制成溶液，放入比色皿中，置于紫外-可见分光光度计，绘得吸收图谱。
（3）定性依据：被测物的结构不同，其电子跃迁方式不同，则产生不同的吸收光谱。根据图谱中的峰位（即最大吸收波长λmax）、谷位（即最小吸收波长λmin）、最大吸收波长处的吸收系数（即E1%1cmλmax）、有无肩峰、特定波长处的吸收度比值等，可以对被测物进行定性。
（4）定量依据--Lambert-Beer定律：A=-lgT=-lg(I/I0)=ECL
式中，A为供试液的吸收度；T为透光率；E为被测物的吸收系数；C为供试液浓度；L为液层厚度；I0为入射光强度；I为透射光强度。
（5）吸收系数：是物质的特性常数。分为百分吸收系数E1%1cm和摩尔吸收系数ε。
3．紫外-可见分光光度计
（1）基本组成：光源→单色器→吸收池→检测器→数据记录和处理。
（2）光源：紫外光区通常采用氢灯或氘灯，可见光区采用钨灯或卤钨灯。
（3）单色器：由色散元件（棱镜或光栅）和狭缝（过宽，光强小，检测灵敏度降低）组成。
（4）吸收池（比色皿）：紫外光测定用石英吸收池；可见光测定用玻璃吸收池。
（5）检测器：常用光电池、光电管、光电倍增管、光二极管阵列检测器。
4．仪器的校正和检定
（1）目的：保证测定结果的准确性。
（2）规定：定期对仪器进行全面校正检定外，还应于测定前对波长进行校正（采用汞灯或氘灯的特征谱线）；吸收度的准确性采用重铬酸钾的硫酸溶液来检定；杂散光则采用碘化钠和亚硝酸钠溶液进行检查。
5．紫外-可见吸收光谱与物质结构的关系
不同结构的物质具有不同的电子能级，其价电子由基态向激发态跃迁时吸收的光能不同，在光谱图的不同波长处产生吸收峰。
（1）σ→σ*跃迁：处于σ成键轨道上的电子吸收光能后跃迁到σ*反键轨道，产生的吸收峰在远紫外区，λmax＜200nm（通常测不出）。
（2）π→π*跃迁：处于π成键轨道上的电子跃迁到π*反键轨道上。孤立π键的λmax=200nm（强吸收）；共轭者的λmax＞210nm。共轭体系越长，跃迁所需的能量越小，吸收峰的波长也越长。
（3）n→π*跃迁：含有杂原子（O、S、N）的不饱和基团（如C=O、C=S、-N=N-）的价电子跃迁。λmax=200～400nm（弱吸收）。
（4）n→σ*跃迁：含-OH、-NH2、-X、-S等基团的化合物中介电子的跃迁。λmax=200（弱→中等强度的吸收）。
在药物分析中应用最多的是共轭体系的π→π*跃迁产生的吸收，n→π*跃迁的吸收有时也可应用。
6．吸收度的测定方法
（1）对溶剂的要求。充分溶解样品、不与样品作用、挥发性小、在测定波长处无干扰（透明）。以空气为空白，溶剂吸收度在220～240nm范围内不得超过0.40，在241～250nm范围内不得超过0.20，在251～300nm范围内不得超过0.10，在300nm以上不得超过0.05。
（2）空白对照试验。用溶剂调节仪器，使吸收度为0或透光率为100%，然后测定样品池的吸收，此时的吸收即为供试品的吸收。
（3）测定波长确证。采用1cm的石英吸收池，核对供试品吸收峰的位置，应在规定吸收峰波长±2nm以内。
（4）供试品溶液的浓度。使用吸收度在0.3～0.7范围内所对应的供试品溶液的浓度。
（5）仪器的狭缝宽度。过大，光纯度变差，则A降低；应以减少狭缝宽度，A不再增加为准。
7．应用
（1）鉴别。同一物质的UV谱应该相同，但是，相同的UV光谱不一定代表同一物质。为了提高UV光谱的专属性，《中国药典》采用下列方式：①对比光谱的特征参数：λmax、λmin、E1%1cm、A、肩峰、吸收谷。②对比吸收度比值的一致性。③对比吸收光谱的一致性。
（2）杂质检查。利用药物和杂质的吸收光谱有明显差别进行检查。若药物无吸收，杂质有吸收，可通过控制其吸收度不得超过规定值控制杂质限量；若药物有吸收，杂质吸收很弱或没有吸收，也可以通过控制其吸收度控制杂质限量。
（3）含量测定。
①对照品比较法。在相同的条件下分别测定供试液（CX）和对照液（CR）的吸收度AX和AR，按下式计算含量：CX=（AX/AR）CR
②吸收系数法。在规定波长处测定供试液的吸收度，依被测组分的吸收系数计算含量。
使用吸收系数法测定时，对仪器须进行严格的校正和检定，如波长的准确度、狭缝宽度等必须符合要求，以保证吸收度测定的准确性。
③计算分光光度法。将测得的吸收度进行适当的数学处理，求得待测组分的含量。例如，双波长分光光度法、导数光谱法等。主要用于消除样品中干扰组分的干扰。
④工作曲线法。配制系列的标准溶液，绘制工作曲线，从中查得供试液含量。
