☆ ☆考点2：丙酸睾酮的分析
1．结构及性质
丙酸睾酮是临床上常用的雄性激素，为睾酮的衍生物，其结构如下：
丙酸睾酮A环有△4-3-酮基，使药物具有紫外吸收；C17上是一个β-羟基所形成的丙酸酯。
2．鉴别
（1）制备衍生物测定熔点。丙酸睾酮用醇制氢氧化钾水解成睾酮，再测定其熔点。
测定方法：取本品约0.1g，加乙醇制氢氧化钾溶液（1→100）10ml，加热回流1小时，放冷，加水10ml，置冰浴中冷却并振摇至析出结晶后，放置，滤过；结晶用冰水洗至洗液显中性，并在105℃干燥，测其熔点为150℃～156℃。
（2）红外光谱法。《中国药典》采用红外光谱法鉴别本品，主要特征峰有：
《中国药典》规定，本品的红外吸收光谱应与对照的图谱一致。
3．其他甾体的检查
本品的含量测定使用高效液相色谱法，在相同的条件下检查有关物质，用不加校正因子的主成分自身对照法检查。
取本品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含1mg的供试品溶液与每1ml含0.02mg的对照溶液。用高效液相色谱法测试，供试品溶液如显示杂质峰，不得超过4个，各杂质峰面积及其总和分别不得大于对照溶液主峰面积的1/2和3/4。
4．含量测定
《中国药典》使用高效液相色谱法测定含量，测定方法为内标法。
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇一水（78：22）为流动相；检测波长为254nm。理论塔板数按丙酸睾酮计算应不低于1000，丙酸睾酮与内标物质峰的分离度应符合要求。
内标溶液的配制：取苯丙酸诺龙约40mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度。
测定方法：取丙酸睾酮对照品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，精密量取该溶液与内标溶液各5ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，取5μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取供试品适量，同法测定，按内标法计算，即得。
首先根据对照品溶液中对照品和内标的峰面积（AR，AS）、浓度（CR，CS）计算校正因子：
再利用f值及供试品溶液中测定组分和内标的峰面积（AX，AS）以及内标物质的浓度（CS）计算供试品溶液中测定组分的浓度。
丙酸睾酮注射液也采用相同的方法测定含量。
☆ ☆☆考点3：黄体酮的分析
1．结构及性质
孕激素也称为黄体激素或孕酮。典型药物为黄体酮。其结构为：
黄体酮的结构特点为：A环上有△4-3-酮基，所以药物有紫外吸收；C17上具有甲酮基。
2．鉴别
（1）与亚硝基铁氰化钠的反应。此反应是黄体酮灵敏、专属的鉴别方法。本品约5mg，加甲醇0.2ml溶解后，加亚硝基铁氰化钠的细粉约3mg，碳酸钠及醋酸铵各约50mg，黄体酮显蓝紫色，其他常用甾体激素均不显蓝紫色，而呈现淡橙色或不显色。
（2）与异烟肼的反应。甾体激素的C3酮基及某些其他位置上的酮基都能在酸性条件下与羰基试剂异烟肼缩合形成黄色异烟腙。
本品甲醇溶液在稀盐酸条件下与异烟肼反应显黄色。
（3）红外光谱法。《中国药典》采用红外光谱法鉴别本品，主要特征峰有：
《中国药典》规定，本品的红外吸收光谱应与对照的图谱一致。
3．其他甾体的检查
采用高效液相色谱法检查有关物质，色谱条件与含量测定相同，检查方法为不加校正因子的主成分自身对照法。
取本品适量，精密称定，以甲醇为溶剂，配制成每1ml中含1mg的溶液（1）与每1m中含0.02mg的溶液（2）。用高效液相色谱法测定，溶液（1）显示的杂质峰数不得超过1个，其面积不得大于溶液（2）主峰面积的3/4。
4．含量测定
采用高效液相色谱法测定。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水（65：35）为流动相；检测波长为254nm；以己烯雌酚（1mg/ml）为内标。测定方法为：取黄体酮对照品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，以甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取该溶液与内标溶液各5ml，置25ml量瓶中，以甲醇稀释至刻度，取5μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取本品适量，同法测定。按内标法以峰面积计算，即得。
含量测定结果的计算公式同丙酸睾酮的分析。
☆ ☆☆☆考点4：炔雌醇及其制剂的分析
1．结构及性质
雌性激素又称为卵泡激素，炔雌醇属此类。其结构为：
炔雌醇A环为苯环，C3上具有酚羟基，C10上无角甲基，C17具有β-羟基和乙炔基。
2．鉴别
（1）与硫酸的反应。本品加硫酸溶解后，溶液显橙红色，在反射光线下出现黄绿色荧光；将此溶液倾入水中，即生成玫瑰红色絮状沉淀。
（2）与硝酸银的反应。C17上的乙炔基可以和硝酸银反应生成白色的炔银沉淀。取本品加乙醇溶解后，加硝酸银试液即生成白色沉淀。
（3）红外光谱法。《中国药典》采用红外光谱法鉴别本品，主要特征峰有：
《中国药典》规定，本品的红外吸收光谱应与对照的图谱一致。
3．其他甾体的检查
采用高效液相色谱法检查其他甾体，方法为不加校正因子的主成分自身对照法。取本品适量，精密称定，以无水乙醇为溶剂，配制成每1ml中含8mg的溶液（1）与每1ml中含0.16mg的溶液（2）。用高效液相色谱法测定，溶液（1）显示的杂质峰数不得超过4个，各杂质峰面积及其总和分别不得大于溶液（2）主峰面积的1/2和3/4。
4．含量测定
（1）炔雌醇的含量测定。采用高效液相色谱法测定。用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-水（70：30）为流动相；检测波长为281nm；以醋酸甲地孕酮（2mg/ml）为内标。取炔雌醇对照品40mg，精密称定，置5ml量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取该溶液与内标溶液各2ml，置10ml量瓶中，以甲醇稀释至刻度，摇匀，取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取本品适量，同法测定。按内标法以峰面积计算，即得。
（2）炔雌醇片的含量测定。使用柯柏反应比色法测定片剂的含量。柯柏反应是指雌性激素与硫酸-乙醇反应显红色。雌性激素的制剂常利用此反应测定含量。由于辅料对测定有干扰，先用水提取出干扰的辅料，再比色测定。
对照品溶液的制备：精密称取炔雌醇对照品25mg，置100ml量瓶中，加无水乙醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取2ml，置50ml量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml中含炔雌醇10μg）。
供试品溶液的制备：取炔雌醇片10片（20μg、50μg、500μg规格）或20片（5μg规格），置具塞试管中，加水10ml，振摇使崩散，置水浴中加热至半透明状，放冷，精密加氯仿10ml振摇，静置分层，吸去上层水溶液，加无水硫酸钠0.5g，振摇脱水后，经干燥滤纸滤过，精密量取续滤液2ml，置水浴中蒸干后，低温干燥，放冷，精密加无水乙醇使溶解制成每1ml中约含10μg的溶液，即得。
测定法：精密量取对照品溶液与供试品溶液各lml，分别置试管中，在冰浴内冷却，各精密滴加硫酸-乙醇（4：1）4ml，摇匀，显色后，照分光光度法，在530nm的波长处分别测定吸收度，计算。
式中，AX、AR--供试品溶液和对照品溶液的吸收度；CR--对照品溶液的浓度，μg/ml；W--片粉的称样量，g； 为平均片重，g；D--稀释倍数。
