三、有关物质的检查
（一）异烟肼中游离肼的检查
异烟肼是一种不稳定的药物，其中的游离肼是由制备时原料引入，或在贮存过程中降解而产生。而肼又是一种诱变剂和致癌物质，因此国内外药典多数规定了异烟肼原料药及其制剂中游离肼的限量检查。常用的方法有薄层色谱法，比浊法和差示分光光度法。
1.薄层色谱法中国药典对异烟肼原料和注射用异烟肼中游离肼的检查均采用此法。
检查方法 取本品，加水制成每1ml中含50mg的溶液，作为供试品溶液。另取硫酸肼加水制成每1ml中含0.20mg（相当于游离肼50μg）的溶液，作为对照溶液。吸取供试液10μl与对照溶液2μl，分别点于同一硅胶薄层板（用羧甲基纤维素钠溶液制备）上，以异丙醇－丙酮（3：2）为展开剂，展开后，晾干，喷以乙醇制对二甲氨基苯甲醛试液，15min后检视，在供试品主斑点前方与硫酸肼斑点相应的位置上，不得显黄色斑点。
异烟肼斑点呈棕橙色的清晰斑点，Rf值约为0.21.游离肼斑点呈鲜黄色，Rf值约为0.3.检出限量约为0.02％。本法检出肼的灵敏度为0.1μg.
BP（1993）亦采用本法检查“游离肼及有关物质”，其检查方法如下：
比浊法
差示分光光度法利用游离肼与对-二甲氨基苯甲醛可形成黄色缩合产物（对-二甲氨基苯甲醛连氮），于456nm波长处有最大吸收；而异烟肼与上述试剂形成的缩合产物（对-二甲氨基苄叉）在此波长处无吸收；根据这一性质，同时运用差示分光光度法，在参比溶液中加3%（V/V）的丙酮，可与肼生成无色的二甲基甲酮连氮，在456nm波长处无吸收；而异烟肼（干扰组分）生成的缩合物在456nm波长处的吸收度与供试溶液（不含丙酮）的吸收度相等，即△A456nm为零，对游离肼测定无干扰。进而，可在456nm波长处测定并计算二者的差示吸收度△A456nm，同时以对照品比较法计算游离肼含量。
参比溶液中丙酮含量在3%时，异烟肼（干扰组分）生成的缩合物在456nm波长处的吸收度与供试溶液（不含丙酮）的吸收度相等，即△A456nm为零，对游离肼测定无干扰。若添加的丙酮量高于或低于3%时，均不能使异烟肼的△A456nm为零。
测定方法如下：
对照品溶液的制备与测定
供试品溶液的制备与测定
（二）尼可刹米中有关物质检查——TLC高低浓度对照法
四、含量测定
（一）异烟肼的含量测定
异烟肼含量测定方法的依据是：具有还原性和能与一些试剂缩合的酰肼基以及吡啶的碱性。常见的方法有溴酸钾法、碘量法、溴量法、非水碱量法或酸量法、非水分光光度法及比色法。其中以溴酸钾法、碘量法、溴量法最为常用。中国药典（1963年版）曾采用溴量法测定异烟肼的含量。由于溴在稀考，试大收集整理盐酸介质中氧化异烟肼，剩余的溴液用碘量法进行测定。本法因操作繁琐、准确度差等原因，故在1977年版药典中改为溴酸钾法。
1. 溴酸钾法 我国药典自1977年版改为在强酸性溶液中用溴酸钾滴定液直接滴定法，用不可逆指示剂乙氧基黄叱精指示终点。由于本法操作简单、准确，1995年版仍用溴酸钾法，但改用甲基橙指示剂指示终点；同时采用本法测定异烟肼片和注射剂的含量。
测定方法 取本品约0.2g，精密称定，置100ml量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取25ml，加水50ml、盐酸20ml与甲基橙指示剂1滴，用溴酸钾滴定液（0.01667mol/L）缓缓滴定（温度保持在18～25℃）至粉红色消失。每1ml的溴酸钾滴定液（0.01667mol/L）相当于3.429mg的C6H7N3O.
2.剩余碘量法
3.非水溶液滴定法
（二）异烟腙及尼可刹米的含量测定
1.非水溶液滴定法——异烟腙及其片剂；尼可刹米原料药
2.紫外分光光度法——尼可刹米注射液
（三）丙硫异烟胺的含量测定
原料药——非水溶液滴定法；片剂——银量法
