☆ ☆考点4：头孢羟氨苄的分析
1．结构
头孢羟氨苄属β-内酰胺类抗生素，由母核7-氨基头孢烷酸和侧链组成。头孢羟氨苄的结构为：
2．鉴别
（1）色谱法。本品采用高效液相色谱法测定含量，可同时进行鉴别。规定在含量测定项下记录的色谱图中，供试品主峰的保留时间，应与对照品主峰的保留时间一致。
（2）红外光谱法。《中国药典》采用红外光谱法鉴别本品，用溴化钾压片，主要特征峰如下表：
《中国药典》规定，本品的红外吸收光谱应与对照的图谱一致。
3．检查
（1）有关物质。主要检查α-对羟基苯甘氨酸、7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸及其他有关物质，采用薄层色谱法检查：取本品，加0.5mol/L盐酸溶液制成每1ml中含50mg的溶液，作为供试品溶液（1）；另取本品、α-对羟基苯甘氨酸与7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸各适量，分别加0.5mol/L盐酸溶液制成每1ml中含0.5mg的溶液，作为对照溶液（2）、（3）与（4）。照薄层色谱法试验，吸取新鲜配制的上述溶液各2μl，分别点于同一薄层板[取经105℃活化1小时的硅胶G板，置新鲜配制的5%（ml/ml）正十四烷的正己烷溶液中，展开至薄层板的顶部，晾干]上，以0.1mol/L。枸橼酸溶液-0.2mol/L磷酸氢二钠溶液-丙酮（120：80：3）为展开剂，展开后，于105℃加热5分钟，趁热喷以用上述展开剂制成的0.7%茚三酮溶液，在105℃加热10～15分钟，取出检视。供试品溶液（1）如显杂质斑点，与对照溶液（3）与（4）相同位置上所显的斑点比较，其颜色不得更深；如显其他杂质斑点，与对照溶液（2）所显的主斑点比较，其颜色不得更深。
本法为反相薄层色谱法。固定相为正十四烷的正己烷溶液，流动相为0.1moL/L枸橼酸溶液-0.2mol/L磷酸氢二钠溶液-丙酮（120：80：3）。由于本品具有类似α-氨基酸的结构，可以和茚三酮反应呈色，所以用茚三酮溶液作为显色剂。本品中α-对羟基苯甘氨酸、7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸和其他有关物质的限度均为1%。
（2）水分。本品分子中含1分子结晶水，理论含水量为4.7%。取本品，照水分测定法（费休法）测定，含水量应为4.2%～6.0%。
4．含量测定
采用高效液相色谱法测定本品的含量。
测定方法：色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基键合硅胶为填充剂；以0.015mol/L醋酸钠溶液（用冰醋酸调节pH至4.0）-甲醇（90：10）为流动相；检测波长为230nm；头孢羟氨苄与7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸峰的保留时间比应不小于2.0。
测定法取本品适量，精密称定，用流动相溶解制成每1ml中约含0.3mg的溶液，取10μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取头孢羟氨苄对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积计算出供试品中头孢羟氨苄（C16H17N3O5S）的含量。
本法为反相高效液相色谱法。为保证药物和杂质完全分离，要求头孢羟氨苄和主要杂质7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸峰的保留时间比应不少于2.0。
本品的片剂、胶囊剂均采用同样的方法测定含量。
5．贮藏
本品应避光，密封，在凉暗处保存。
☆☆☆☆☆考点5：硫酸链霉素和硫酸庆大霉素的分析
1．结构及性质
硫酸链霉素和硫酸庆大霉素属氨基糖苷类抗生素，为氨基环己多元醇和氨基糖形成的苷。其结构如下：
链霉素分子中有3个碱性中心（式中*处），为碱性化合物，药物为链霉素的硫酸盐。硫酸链霉素易溶于水，其水溶液以pH5～7.5最为稳定，过酸或过碱的条件易水解失效。
庆大霉素分子中有五个碱性中心，也为碱性化合物，药物为庆大霉素的硫酸盐。硫酸庆大霉素易溶于水，水溶液稳定。庆大霉素是C组分的复合物，主要成分为C1、C2、C1a及C2a等，其结构如下表：
2．鉴别
（1）硫酸链霉素的鉴别
①茚三酮反应。链霉素分子中有α-羟基胺结构，类似于α-氨基酸，可与茚三酮缩合成蓝紫色缩合物，以供鉴别。
②N-甲基葡萄糖胺的反应。链霉素经水解，产生N-甲基葡萄糖胺，在碱性溶液中与乙酰丙酮缩合成吡咯衍生物，再与对二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液反应，生成红色缩合物。
③麦芽酚反应。链霉素在碱性溶液中，链霉糖经重排使环扩大形成麦芽酚，麦芽酚可与Fe3+在微酸性溶液中形成紫红色配位化合物，此反应为链霉素特有的反应，专属性强。《中国药典》采用麦芽酚反应进行鉴别。取本品约20mg，加水5ml溶解后，加氢氧化钠试液0.3ml，置水浴上加热5分钟，加硫酸铁铵溶液0.5ml，即显紫红色。
④坂口反应。是基于链霉胍的显色反应。本品的水溶液在碱性条件下水解生成链霉胍，链霉胍和8-羟基喹啉分别同次溴酸钠反应，各自的产物再相互作用，生成橙红色化合物。
鉴别方法：取本品约0.5mg，加水4ml溶解后，加氢氧化钠试液2.5ml与0.1% 8-羟基喹啉的乙醇溶液1ml，放冷至约15℃，加次溴酸钠试液3滴，即显橙红色。
⑤硫酸盐的鉴别。照《中国药典》附录“一般鉴别试验”中“硫酸盐”的鉴别方法试验。
（2）硫酸庆大霉素的鉴别
①茚三酮反应。取本品约5mg，加水1ml溶解后，加0.1%的茚三酮的水饱和正丁醇溶液1ml与吡啶0.5ml，在水浴中加热5分钟，即显紫蓝色。
②N-甲基葡萄糖胺的反应。庆大霉素也有N-甲基葡萄糖胺结构，可在碱性溶液中与乙酰丙酰缩合成吡咯衍生物，再与对二甲氨基苯甲醛的酸性醇溶液反应，生成红色缩合物。
③薄层色谱法。取供试品溶液和对照品溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，用氯仿-甲醇-氨水（1:1:1）的下层混合液为展开剂，展开后，晾干，置碘蒸气中显色，供试品溶液和对照品溶液所显斑点的颜色和位置应一致。
3．检查
（1）硫酸链霉素的检查
①干燥失重。取本品，以五氧化二磷为干燥剂，在60%减压干燥4小时，减失重量不得超过6.0%。由于本品受热易分解，所以采用恒温减压干燥的方法测定。
②异常毒性。取本品，加氯化钠注射液制成每1ml中含2600单位的溶液，照《中国药典》附录“异常毒性检查法”检查，按静脉注射法给药，观察24小时，应符合规定。
③热原。取本品，用灭菌注射用水制成每1ml中含2万单位的溶液，按《中国药典》附录“热原检查法”检查，剂量按家兔体重每1kg注射0.5ml，应符合规定。
④降压物质。取本品，按《中国药典》附录“降压物质检查法”检查，剂量按猫体重每1kg注射3000U，应符合规定。
⑤无菌。取本品，分别加入100ml 0.9%无菌氯化钠溶液使溶解，用薄膜过滤法处理后，按《中国药典》附录“无菌检查法”检查，应符合规定。
由于药物本身有抗菌作用，采用过滤法检查，用微孔滤膜滤除药物溶液，取滤膜进行试验，应符合规定。
（2）硫酸庆大霉素的检查
①水分的检查。取本品，照水分测定法（费休法）测定，含水分不得过15.0%。
②硫酸盐。本品为硫酸盐，此项目是检查S042-的量是否符合要求。本品中SO42-含量的理论值约为34%，《中国药典》使用配位滴定法测定，规定应为32.0%～35.0%。方法为：取本品约0.125g，精密称定，加水100ml使溶解，用浓氨溶液调节pH值至11，精密加氯化钡滴定液（0.1mol/L）10ml及酞紫指示液5滴，用乙二胺四醋酸二钠滴定液（0.05mol/L）滴定，注意保持滴定过程中的pH值为11，滴定至紫色开始消退，加乙醇50ml，继续滴定至紫蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml氯化钡滴定液（0.1mol/L）相当于9.606mg硫酸盐（SO42-），本品含硫酸盐按无水物计算应为32.0%～35.0%。
先加入一定量过量的氯化钡滴定液，Ba2+与SO42-形成BaSO4沉淀，剩余的Ba2+再用EDTA滴定液滴定，用酞紫作指示剂。1mol的BaCl2相当于1mol的SO42-，所以1ml氯化钡滴定液（0.1mol/L）相当于9.606mg的SO42-。
③异常毒性。取本品，加氯化钠注射液制成每1ml含1000单位的溶液，按《中国药典》附录“异常毒性检查法”检查，按静脉注射法给药，观察24小时，应符合规定。
④细菌内毒素。取本品，照《中国药典》附录“细菌内毒素检查法”检查，每1000庆大霉素单位中含内毒素的量应小于0.5EU。
⑤降压物质。取本品，按《中国药典》附录“降压物质检查法”检查，剂量按猫体重每1kg注射2000单位计算，应符合规定。
⑥C组分的检查。庆大霉素是C组分的复合物，不同的C组分活性无明显差异，但其毒副作用不同，所以需控制C组分的相对含量。
检查方法：色谱条件与系统适用性试验 十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以水-冰醋酸-甲醇（25：5：70）配制的0.02mol/L庚烷磺酸钠溶液为流动相；检测波长为330nm。理论塔板数按C2组分峰计算，应不低于2000。C2α峰和C2峰的分离度应符合要求。重复进样，其相对标准差（RSD）应小于2.0%。
测定方法：取本品适量，精密称定，加水制成每1ml中含0.65mg的溶液，取4ml置10ml量瓶中，加异丙醇2ml与邻苯二醛试液1.6ml，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，置60℃水浴中加热15分钟，冷却，滤过，量取滤液10μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图。另取庆大霉素标准品，同法测定。C组分的保留时间依次为：C1、C1α、C2α、C2。量取C1、C1α、C2α、C2的峰高，按下式计算：
式中，CX'--供试品中Cx组分的含量；HX'--供试品Cx组分的峰高值；RX--CX组分的响应因子 ；FX--标准品中Cx组分的含量标准值；HX--标准品中CX组分的峰高值。C1应为25%～50%，C1a应为15%～40%，C2+ C2a应为20%～50%。
4．含量测定
采用抗生素微生物检定法测定硫酸链霉素和硫酸庆大霉素的含量。要求硫酸链霉素每1mg的效价不得少于720链霉素单位；硫酸庆大霉素每1mg的效价不得少于590庆大霉素单位。
