☆考点6：罗红霉素的分析
1．结构
罗红霉素属大环内酯类抗生素，是内酯环与去氧氨基糖和红霉糖所成的苷。罗红霉素为9-{O-[（2-甲氧基乙氧基）-甲基]肟}红霉素，其结构如下：
2．鉴别
（1）薄层色谱法。取本品和罗红霉素标准品，配成每1ml中含20mg的溶液，在有关物质检查薄层条件下，点样，展开，供试品所显主斑点的颜色和位置应与标准品一致。
（2）红外光谱法。《中国药典》采用红外光谱法鉴别本品，要求供试品的红外吸收光谱应与对照的图谱一致。
3．检查
（1）碱度。结构中的氨基糖上有二甲氨基，具碱性。取本品0.1g，加水150ml，振摇，测定pH值，应为8.0～10.0。
（2）有关物质。采用薄层色谱法检查。
检查方法：取本品，加甲醇制成每1ml中含20mg的溶液，作为供试品溶液；另取罗红霉素标准品，分别加甲醇制成每1ml中含0.4mg、0.2mg、0.1mg和0.04mg的溶液，分别作为对照溶液（1）、（2）、（3）和（4），取供试品溶液和对照溶液各10μl，点于同一硅胶G薄层板上，用甲苯-氯仿-二乙胺（50：40：7）为展开剂，展开后，晾干，喷以磷钼酸溶液显色。供试品如显杂质斑点，各杂质斑点所显的颜色分别与对照溶液（1）、（2）、（3）所显主斑点比较，计算杂质的总量，不得超过5.0%。且各杂质斑点的颜色均不得比对照溶液（1）所显斑点更深。
（3）水分。取本品，加吡啶溶解，用水分测定法（费休氏法）测定，含水分不得过3.0%。
由于本品中的酮基可和甲醇反应生成水，干扰测定，所以用吡啶代替甲醇作溶剂溶解样品。
（4）异常毒性。取本品，加无水乙醇适量溶解，用注射用水稀释成每1ml中含2500单位的溶液，照“异常毒性”检查法检查，按腹腔注射给药，应符合规定。
4．含量测定
《中国药典》采用抗生素微生物检查法测定本品的效价，规定按无水物计算，每1mg的效价不得少于940罗红霉素单位。
罗红霉素片和罗红霉素胶囊，均采用同样的方法测定含量。
☆ 考点7：盐酸美他环素的分析
1．结构及性质
盐酸美他环素属四环素类的药物，为四并苯的衍生物。其结构如下：
盐酸美他环素结构中有较长的共轭体系，因此有紫外吸收，分子中的二甲氨基具有碱性，药物为美他环素的盐酸盐。药物结构中还具有酮基、酰胺基和酚羟基等。
2．鉴别
（1）紫外分光光度法。本品中有紫外吸收，可用紫外分光光度法鉴别。用1mol/L盐酸的甲醇溶液（1→100）制成每1ml中含10μg的溶液，用紫外分光光度法测定，在345nm处有最大吸收，其吸收度应为0.31～0.33。
（2）高效液相色谱法。本品采用高效液相色谱法测定含量，可同时进行鉴别。规定在含量测定项下记录的色谱图中，供试品主峰的保留时间应与对照品主峰一致。
（3）氯化物的鉴别反应。本品为盐酸盐，应显氯化物的鉴别反应。照《中国药典》附录“一般鉴别试验”中“氯化物”的鉴别方法试验。
3．检查
（1）杂质的吸收。检查杂质的吸收主要是控制本品中的差向异构体，脱水美他环素以及其他杂质的量。此类杂质在490nm的波长处有较强吸收，通过控制样品在490nm处的吸收度，达到控制此类杂质量的目的。取本品，用1mol/L盐酸甲醇溶液（1→100）制成每1ml中含有10mg的溶液，在490nm处测定吸收度，不得过0.20。
（2）有关物质。有关物质主要是控制生产过程中引入的土霉素。采用高效液相色谱法检查。方法为：取本品，加0.01mol/L盐酸溶液溶解并稀释成每1ml中含0.2mg和2μg的溶液，作为供试品溶液和对照溶液。在含量测定的色谱条件下，分别取供试品溶液和对照溶液各20μl进样，记录色谱图，供试品溶液中土霉素的峰面积不得大于对照溶液主峰的面积。
4．含量测定
采用高效液相色谱法测定本品的含量。高效液相色谱法分离效能高，可有效地分离异构体、降解产物等杂质，使测定结果更加准确。
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；0.05mol/L草酸铵溶液-二甲基甲酰胺-0.2mol/L磷酸氢二铵溶液（65：27：7）用磷酸调节pH至7.6±0.2为流动相；流速为每分钟1.0ml；柱温35℃；检测波长280nm。同时精密称取土霉素对照品、美他环素对照品适量，用0.01mol/L盐酸溶液溶解并制成每lml中各含0.08mg的混合溶液，进样测试，土霉素峰与美他环素峰的分离度应大于4.0。
测定法取本品20mg，精密称定，置25ml量瓶中，加0.01mol/L盐酸溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，加0.01mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取美他环素对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积计算。
本法为反相高效液相色谱法。系统适用性试验主要考察美他环素和土霉素的分离度，应大于4.0。含量测定的结果按外标法计算：
式中，Ax--供试品溶液中美他环素的峰面积；AR--对照品溶液中美他环素的峰面积；WR--美他环素对照品的称样量，mg；Wx--供试品的称样量，mg。
盐酸美他环素片、盐酸美他环素胶囊均采用同样的方法测定含量。
